miRNA調控畜禽剩余采食量的研究進展

白皓, 楊寶龍, 董釗綺, 李瀟凡, 江勇, 常國斌,, 陳國宏,*

(1.揚州大學農業科技發展研究院， 教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室， 江蘇 揚州 225009；2.揚州大學動物科學與技術學院， 江蘇 揚州 225009)

在畜禽生產中，飼料成本占整個養殖成本的70%以上[1]，有效降低畜禽的采食量，提高飼料利用率,可以大大降低養殖成本。近年來，隨著人們消費水平的提高以及對產品質量的追求，優質型畜禽產品市場需求越來越大，但優質畜禽生長速度慢、飼料利用率低，嚴重阻礙了產業發展。因此，針對飼料利用率性狀的選育成為育種學家關注的焦點。生產中通常采用飼料轉化率(feed conversion rate, FCR)來衡量飼料利用率。然而，FCR作為一個比值并不能很好地區分出用于生長需要和維持需要的采食量，并且與平均日增重(average daily gain, ADG)、出欄體重等重要經濟性狀呈遺傳負相關。因此，在提高畜禽飼料利用率上，FCR不適合優質畜禽的選育。剩余采食量(residual feed intake, RFI)被認為是更適合于衡量畜禽飼料利用率的重要指標[2]。RFI屬于中等或中上遺傳力，大約在0.2～0.5之間，有很好的選擇反應，有利于進行遺傳選育，提高飼料利用率。目前，在牛、豬、雞等畜禽中已采用RFI對飼料利用率進行選育，遺傳進展明顯。

microRNA(miRNA)是調控基因表達的重要內源性非編碼小分子RNA。miRNA調控60%的蛋白編碼基因的翻譯過程，參與機體的細胞增殖、分化、凋亡、能量代謝和信號轉導等過程[3]。已有研究表明，miRNA參與調控動物機體的采食及能量代謝。如miR-499和miR-15a可分別通過其靶基因TCF12和FOXO1介導AMPK-PGC-1α、TGF-β以及PI3K-AKT-mTOR等信號通路調控動物采食，增強機體吸收利用[4-5]。目前，關于miRNA通過靶基因調控畜禽飼料利用率的研究，特別是針對RFI性狀的研究較少。本文綜述了近年來畜禽RFI的研究現狀，特別是miRNA在畜禽RFI中的研究進展，有助于揭示畜禽RFI性狀的分子調控機理，為畜禽飼料利用率的改良與高效生產提供新思路，為優質畜禽的分子選育工作提供理論依據。

1 畜禽采食行為調控機制

畜禽采食行為的研究主要集中在從生物學角度解析采食調控機制，為采食調節和肥胖等健康問題的研究提供理論基礎。下丘腦作為控制采食的核心中樞，包括弓狀核(arcuate nucleus，ARC)、旁室核(paraventricular nucleus，PVN)、腹內側核(ventromedial nucleus，VMN)、背內側核(dorsomedial nucleus，DMN)和下丘腦外側區(lateral hypothalamic area，LHA)5個主要核團，通過相互作用形成厭食和飽食信號來調控采食[6]，維持能量代謝平衡。下丘腦中樞神經系統主要含有兩種神經元亞群：促進采食的神經肽Y/刺鼠相關蛋白(NPY/AgRP)神經元和抑制采食的阿黑皮素原/可卡因-安菲他明調節轉錄肽(POMC/CART)神經元。下丘腦神經元能夠影響多種采食調節因子的表達或與其相應受體的結合，對胰島素(insulin)、瘦素(leptin)、胃饑餓素(ghrelin)和膽囊收縮素(cholecystokinin)等激素做出相應調整，從而實現對采食和飼料利用率的調控。如酪酪肽(peptide tyrosine tyrosine, PYY)受其靶向結合miR-652的抑制作用，其3’-UTR的T146C突變導致靶向結合位點發生改變，最終抑制采食[7]。調節畜禽采食和能量代謝，并使其達到能量平衡、體重穩定狀態是一個復雜的過程，目前尚未完全清晰。畜禽采食行為不是由單一信號傳導所決定的，而是通過多種神經遞質、激素和調控因子相互作用共同影響的。調控采食的各種信號傳遞到下丘腦，下丘腦產生的神經肽通過核團之間傳遞信號，在下丘腦神經細胞內得到整合及加工，引起與采食相關的中樞興奮，最終實現對采食的調控。大量研究表明，下丘腦中的單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)[8]和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)[9]通過AMPK-ACC-CPT1、PI3K-AKT-mTOR等代謝途徑和信號通路在調控采食和能量平衡過程中發揮著關鍵作用，涉及IGF-I、LEPR、FABP、TGF-β、FOXO1、GHSR、MCR等關鍵調控基因。采食行為調控機制的研究已經成為畜禽產業關注的熱點，探明畜禽采食規律和作用機制對促進畜禽生長、提高飼料利用率、培育優質畜禽品種和提高經濟效益具有重要意義。如何在現有研究的基礎上確定關鍵調控因子，理清相關信號通路和采食調控網絡是研究的難點，也是有效調控畜禽采食行為的前提和保障。

2 RFI及其研究現狀

Koch等[2]于1963年首次提出剩余采食量(RFI)的概念，其本質是基于維持需要和滿足生長性能需要的預期采食量和實際采食量之間的差異，也稱為凈采食效率。當個體RFI=0時，表示實際采食量與預期釆食量一致，當RFI為正值或負值時，則分別表示實際采食量多于或少于預期采食量。RFI是反映飼料利用率的可遺傳性狀，獨立于生產性能、體型大小等性狀，充分考慮了畜禽的平均日增重并且校正了個體的代謝體重。2007年8月，聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)動物遺傳資源委員會專家團推薦各國采用RFI作為飼料利用率的選育指標。因此，RFI被認為是一種更適合于衡量畜禽飼料利用率的重要指標。研究表明，采食量有35%的差異可以通過RFI進行評估[10]。Herd和Arthur[11]闡述了RFI的生理基礎，主要有6個生理過程：蛋白轉運及組織代謝和應激(37%)、消化(10%)、活動(10%)、產熱發酵(9%)、身體組成(5%)、飼養方式(2%)以及其他因素(27%)。

2.1 遺傳變異對RFI性狀的影響

近年來，RFI在牛、豬、雞等畜禽上已取得了一定的進展，但其分子機制復雜多樣。Sherman等[12]研究發現，有6個SNPs對牛的RFI有顯著作用。Hou等[13]發現443個CNV區域與牛RFI性狀相關。全基因組關聯分析(genome-wide association study, GWAS)發現，牛的6號和21號染色體上存在與RFI性狀相關的QTL區域[14-15]。Fan等[16]利用SNP芯片分析發現，FTO基因和TCF7L2基因與豬RFI性狀顯著關聯。Riquet等[17]利用SNP芯片分析發現，在豬的16號染色體上存在1個與RFI性狀相關的QTL區域。Bai等[18]針對軍牧1號白豬進行GWAS研究，發現12個與豬RFI性狀顯著關聯的位點。Xu等[19]研究優質黃羽肉雞RFI發現，位于12號染色體的顯著關聯區域與能量利用相關。Liu等[20]利用全基因組重測序的方法鑒定到3 746個與北京油雞RFI性狀相關的SNPs；同時鑒定到575個與科寶肉雞RFI性狀相關的SNPs。

2.2 基因表達對RFI性狀的影響

與牛RFI性狀相關的基因主要涉及能量代謝、轉錄調節、細胞周期和細胞凋亡等生物過程[21]。Weber等[22]研究發現，高低RFI安格斯牛存在633個差異表達基因。Kong等[23]研究發現，在低RFI牛上存在85個上調和37個下調基因。Byerly等[24]最早在家禽中研究RFI，對RFI性狀進行選育可以有效提高雞的飼料利用率。Sintubin等[25]研究發現，不同RFI雞群之間，SOCS3、GHRP等基因表達差異顯著。Yi等[26]利用RNA-seq技術鑒定到41個與蛋雞RFI性狀相關的基因。Liu等[27]利用RNA-seq技術鑒定到599個與肉雞RFI性狀相關的基因，主要與采食、代謝、消化功能和免疫相關。Zeng等[28]通過比較高低RFI的蛋鴨發現PLCD4、FCN2和FABP1等35個差異表達基因。金四華等[29]針對肉鴨RFI可能的候選基因PRKAA1、PRKAA2、APOA4、PRKAG2和CCKAR等開展了相關功能研究。

上述畜禽RFI性狀的研究主要集中在結構變異和基因表達方面，而分子調控和表觀修飾方面對畜禽RFI性狀也具有重要的作用。已有研究表明，miRNA與動物機體的采食及能量代謝密切相關，參與調控牛、豬、雞等畜禽的RFI。

3 miRNA調控畜禽RFI性狀

miRNA是一類通過轉錄后抑制基因表達的內源性非編碼單鏈RNAs，長度約為22 nt，是基因表達的重要調控因子。miRNA最早是在研究秀麗隱桿線蟲的發育時被發現的[30]。miRNA主要通過與靶基因mRNA 3’-UTR不完全互補配對，在轉錄后水平抑制靶基因的作用。在互補配對過程中，miRNA 5’-UTR的2～8堿基對非常關鍵，被稱為種子序列，這幾個堿基突變對miRNA生物學功能影響很大。miRNA調控60%的蛋白編碼基因的翻譯過程，參與機體的細胞增殖、分化、凋亡、能量代謝和信號轉導等過程[3]。因此，miRNA可通過對靶基因進行調控進而影響畜禽RFI性狀發生變化。近幾年，miRNA的研究已成為熱點，截至目前，Pubmed數據庫已經有超過十萬篇關于miRNA的文章發表。

3.1 miRNA對牛RFI性狀的影響

在肉牛研究方面，Al-Husseini等[31]通過對高低RFI的安格斯牛進行高通量測序，獲得全面的miRNA表達譜，并鑒定了與肉牛飼料利用率相關的miRNA。鑒定到的305個miRNA中， miR-30、miR-122、miR-143、miR-378和let-7是肝臟中表達最多的，占表達量的63%以上。通過比較高低RFI牛之間的差異表達miRNA，發現miR-143在肝臟中表達最豐富，占總表達量的20%，同時還確定了10個新的牛特異性表達的miRNA。De Oliveira等[32]開展了差異miRNA表達和加權基因共表達網絡分析(WGCNA)，研究miRNA與牛骨骼肌和肝臟中表達的mRNA之間的相互作用。結果顯示，共鑒定到310個牛的miRNA，其中miR-7、miR-15a、miR-21、miR-29、miR-30b、miR-106b、miR-199a-3p、miR-204、miR-296和miR-486可能與RFI性狀變異相關。同時，針對差異表達miRNA的靶基因和miRNA-mRNA相關模塊進行功能富集分析發現，與RFI性狀相關的通路涉及胰島素、脂質、免疫系統、氧化應激和肌肉發育等信號通路。Carvalho等[33]研究表明，低RFI牛中miR-665表達較高，而高RFI的骨骼肌中miR-34a和miR-2899表達較高，同時這些miRNA相應調節蛋白在高低RFI的骨骼肌中差異顯著，因此這3個miRNA可能與牛RFI變異相關。這些發現提示了miRNA對RFI性狀調控的可能，為肉牛飼料利用率的分子調控機理研究提供了重要的理論依據。

3.2 miRNA對豬RFI性狀的影響

在豬研究方面，Jing等[4]通過分析不同RFI的豬骨骼肌的轉錄組，鑒定到99個高低RFI的差異表達基因，其中下調基因主要參與調節線粒體能量代謝，而上調基因主要參與骨骼肌的增殖和分化。同時鑒定到15個差異表達的miRNA可能與豬RFI性狀相關，包括miR-1、miR-10b、miR-29c、miR-30e-5p、miR-99b、miR-101、miR-136、miR-145、miR-191、miR-199a、miR-208b、miR-215、miR-365-5p、miR-486和miR-1271，涉及AMPK-PGC-1α、IGF-1/2、TGF-β等能量代謝相關的信號通路。該研究表明，通過降低肌肉中的能量代謝，特別是線粒體代謝，可促進骨骼肌的生長，提高豬的飼料利用率。廖明星[34]通過對大白豬群體高低RFI不同個體做RNA-seq和miRNA-seq，分別得到了一些差異表達的mRNA與miRNA。鑒定并初步驗證了miRNA-29c可能為豬RFI性狀的重要候選miRNA，并且推斷此miRNA可通過靶向調控ARRDC3、CYCS以及ZFP36L1等基因來調控RFI。這些研究為豬飼料利用率的分子調控機理研究和優質地方豬種的分子選育工作提供了新的思路。

3.3 miRNA對家禽RFI性狀的影響

在家禽研究方面，Luo等[35]通過RNA-seq測序技術鑒定到miR-1596與肉雞RFI性狀顯著關聯。后續功能驗證研究表明，miRNA-1596上游95 bp處A→T的突變與RFI顯著相關，其中AA基因型的肉雞RFI更低，而miR-1596-3p表達水平更高，其遺傳變異可能是通過改變成熟的microRNA(miR-1596-3p)在雞肝臟中的表達水平來促進RFI的變化。Yuan等[5]針對808只洛島紅母雞進行GWAS研究，鑒定到3個高度連鎖的SNP位點與飼料利用率顯著相關，位于miR-15a上游13.55～45.16 kb區間內。qRT-PCR的結果顯示,miR-15a在髙飼料轉化率組個體肝臟中的表達量顯著高于中等和低飼料轉化率組個體。miR-15a的其中一個靶基因FOXO1參與到AMPK信號通路中，從而影響食欲和采食行為。另外，Khatri等[36]通過比較白羽肉雞(高飼料轉化率且生長速度快)和橫斑蘆花雞(低飼料轉化率且生長速度慢)發現了一些關鍵miRNA與RFI相關，如miR-10a-5p、miR-125b-5p、miR-126-3p、miR-146b-5p、miR-146c-5p、miR-221-5p、miR-2131-5p和let-7b等在高飼料轉化率的白羽肉雞胸肌中上調，而miR-206在胸肌中下調。差異miRNA靶基因的功能網絡分析表明，它們參與了鈣信號傳導、軸突指導信號傳導和NRF2介導的氧化應激反應等信號通路，調控了胸肌的生長發育。這些研究也為家禽飼料利用率的改良提供了理論依據、新角度和新思路，為小體型優質家禽品種的分子選育工作提供了理論基礎。

綜上所述，miR-15a、miR-30、miR-199a、miR-486、let-7等在不同畜禽中都鑒定到的miRNA可能是參與畜禽飼料利用率調控的關鍵miRNA(表1)。目前，關于miRNA通過靶基因調控畜禽飼料利用率的研究仍處于起步階段，miRNA參與RFI的分子調控網絡十分復雜，各個miRNA對于RFI變異的貢獻程度還需要進行更深入的研究。

表1 與畜禽RFI相關的miRNAsTable 1 miRNAs related to RFI of livestock and poultry

4 結語

RFI作為畜禽飼料利用效率性狀，是一個非常復雜的數量性狀，受多種生理因素影響。因此，深入挖掘畜禽RFI的生物學基礎有助于進一步提高畜禽的飼料利用率，為未來飼料利用率及多性狀育種方案制定提供可靠參考信息。RFI屬于中等或中上遺傳力，通過分子標記輔助育種可以更容易地獲得RFI理想的畜禽群體，提高飼料利用率，降低養殖成本，增加經濟效益。本文總結了近年來miRNA在牛、豬、家禽等畜禽RFI中的研究進展，目前主要研究方法是通過對高低RFI畜禽不同組織或器官的miRNA表達量差異分析，鑒定出與RFI性狀相關的關鍵miRNA及其靶基因。從近5年的研究結果來看，有大量的SNP、基因和通路等通過參與能量代謝來調控RFI性狀。可以明確的是，miRNA可以通過作用于靶基因參與調控畜禽的采食及能量代謝，然而miRNA介導的RFI分子調控機理目前尚不清楚。因此，需要對RFI性狀進一步深入研究，找到關鍵miRNA及其作用的靶基因以及與性狀變異相關的關鍵靶組織或器官，從分子、細胞和活體等多層次水平深入解析關鍵miRNA參與調控畜禽RFI的分子機理，不僅有助于揭示該性狀的遺傳本質，還有助于培育出飼料利用率高的畜禽品種，促進我國畜牧業的優質高效發展。