不同宿主源弓形蟲ROP16基因的遺傳變異分析

黃勉, 馮偉利, 植廣林, 楊子鵬, 左珂菁,楊曉穎, 陳絢姣, 袁浩, 袁子國*

(1.廣州動物園, 廣州 510070; 2.華南農業大學獸醫學院, 廣州 510642)

剛地弓形蟲是一種專性胞內寄生原蟲，能感染包括人類、畜禽、鳥類在內的幾乎所有溫血動物[1-2]。妊娠動物感染弓形蟲可垂直傳播至子代，形成先天性弓形蟲病，造成先天性缺陷或者死亡。動物眼部發生感染時，若處理不當，可造成嚴重的視力障礙[3-4]。弓形蟲病爆發也能帶來畜牧業的重大經濟損失，動物弓形蟲感染的陽性率為0.35%～85%，常呈現局部暴發流行[5]。近年來，豬弓形蟲病的相關報道日漸增多，在我國能夠自然感染弓形蟲的15種動物中，豬的感染陽性率最高。20世紀80年代，豬無名熱正是豬弓形蟲病引起。因弓形蟲病豬與豬瘟病豬癥狀類似，且多伴有混合感染或繼發感染，所以對養豬業造成的影響較大[6]。棒狀體是寄生蟲的一種細胞亞器，蛋白組學研究表明,弓形蟲棒狀體共分泌30多種蛋白，根據在棒狀體內的定位，這些蛋白可分為棒狀體基部蛋白(rhoptry proteins, ROPs)和棒狀體頸部蛋白(rhoptry neck proteins, RONs)兩類。ROPs是弓形蟲特異性蛋白，包括ROP2、ROP3、ROP4、ROP5、ROP7、ROP8、ROP16、ROP18等，可調控弓形蟲入侵、生長、毒力及納蟲空泡(parasitophorous vacuole, PV)形成過程[7-9]。一般將ROPs分為ROP1和ROP2兩個蛋白家族。與ROP1蛋白家族相比，ROP2蛋白家族成員眾多，包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP16以及ROP18。大部分ROP2家族成員能在蟲體入侵時定位于納蟲空泡膜(parasitophorous vacuole membrane, PVM)，起聯系宿主細胞和PV的作用，該類蛋白的絲氨酸、蘇氨酸激酶區發揮著重要作用[10]。ROP18是一種絲氨酸—蘇氨酸激酶，是弓形蟲毒力最重要的蛋白之一，被認為是弓形蟲入侵的關鍵毒力因子[11-12]，ROP18基因位于染色體Ⅶa，接近編碼標記CS3的基因[13-14]。研究表明，ROP18單獨或與ROP5組合分析可以有效地測定新型弓形蟲分離株對小鼠的毒力[15]。ROP16幾乎與ROP18同時被發現，亦為重要毒力因子[16-17]，其與宿主細胞內STAT3、STAT6發生磷酸化，干擾宿主細胞內信號通路傳導[16]。Yamamoto等[18]證實Ⅰ型弓形蟲ROP16缺陷株不能激活STAT3，從而導致IL-6和IL-12 p40上調。進一步比較Ⅰ型和Ⅱ型弓形蟲蟲株ROP16間差異，發現Ⅱ型蟲株激酶區存在一個關鍵氨基酸替代，導致其在胞內STAT3的磷酸化水平有較大差異。綜上所述，棒狀體蛋白ROP16在蟲體入侵宿主、PV形成和毒力作用方面發揮著重要作用，是弓形蟲毒力調節因子，在弓形蟲逃避宿主的免疫應答中起著非常重要的作用[18]。由于弓形蟲Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型和不同分離蟲株毒力存在差異，以Ⅰ型標準蟲株為參考，旨在研究不同來源蟲株TgROP16的序列遺傳演化分析，為了解我國弓形蟲的流行趨勢和遺傳進化提供參考，也為弓形蟲通用免疫制劑的研制提供靶標。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1樣品來源 弓形蟲ME49株、RH株、VEG株、PRU株均來自華南農業大學獸醫學院寄生蟲教研室；其他樣品來自廣東省某動物園(表1)。

表1 弓形蟲株樣品來源Table 1 Details of T.gondii isolates used in the study

1.1.2主要試劑 1×PBS為HyClone公司產品；限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、TaqDNA 聚合酶均為TaKaRa公司產品；DNA Kit試劑盒、小提質粒試劑盒、UNIQ-5柱式DNA膠回收試劑盒均購自TIANGEN生物技術有限公司；DH5α感受態細胞為全式金公司產品。引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1樣品DNA 的提取 將凍存的弓形蟲ME49株、VEG株、PRU株從液氮中取出，立即放入37 ℃的溫水中解凍，待完全融化之后腹腔注射健康的BALB/c小鼠。經過3～5 d，小鼠出現被毛粗亂、弓背閉目、精神萎靡、腹部膨大等癥狀后脫頸處死，向腹腔注入1 mL 1×PBS沖洗腹腔，收集腹腔液。將抽取的腹腔液注入到空白小鼠腹腔內，傳代3次，以保持弓形蟲的感染活力和毒力，收集腹腔液，-20 ℃冰箱保存備用。樣品蟲株及環尾狐猴源、人源、豬源共4株弓形蟲臨床分離株使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取全基因組DNA。

1.2.2弓形蟲ROP16基因的擴增及純化 根據弓形蟲ROP16(GenBank No. DQ116422.1)序列，用Primer Premier 5.0設計引物(F：5′-GAATT-CATGAAAGTGACCACGAAAG-3′，R：5′-GCGGC-CGCCTACATCCGATGTGAAGAAAGTT-3′)進行PCR擴增。

反應體系25 μL：12.5 μL 2×TaqPlus Master Mix，8.5 μL dd H2O，上下游引物各2.5 μmol·L-1，DNA樣品2 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 延伸30 s，72 ℃ 2.5 min，32個循環；72 ℃終延伸7 min。將PCR產物用10 g·L-1瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳液中電泳，按試劑盒說明回收純化目的基因。

1.2.3弓形蟲ROP16基因序列測定 將純化的PCR產物克隆到pMD18-T載體上，構建pMD18-ROP16重組質粒,將其轉化DH5a感受態細胞, 用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，并進行PCR酶切和序列測定。

1.2.4限制性片段長度多態性PCR(PCR-RFLP)分析 在0.5 mL EP管中分別加入dd H2O、限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、Buffer、PCR產物，反應體系為20 μL，并根據各內切酶適宜的反應溫度水浴2 h。酶切產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳觀察并成像。

1.2.5弓形蟲ROP16的序列分析及進化樹的建立 用DNA Star軟件對測序結果進行分析和比較。用MEGA 5.05軟件建立系統進化樹[19]。

2 結果與分析

2.1 不同宿主ROP16基因的序列分析

用提取的9株樣品基因組DNA為模板，經PCR擴增均出現1條與預期片段(2 124 bp)大小一致的條帶。測序結果分析發現，ROP16基因核苷酸序列的第68、242位等29個位點發生了變異(表2)。9株序列堿基中A+T含量在46.94%～47.03%，其中27處出現C?T、A?G、A?C、G?T突變，2處發生A?T、G?C突變。

表2 不同弓形蟲樣品ROP16基因堿基序列比較結果Table 2 Nucleotide polymorphisms of the ROP16 gene from different T. gondii strains

2.2 不同來源的ROP16 PCR-RFLP分析

9個擴增產物經限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ和XhoⅠ作用后均出現2條清晰的條帶，其中經BamHⅠ酶切得到0.7 kb左右片段，經HindⅢ酶切得到0.5 kb左右片段，經XhoⅠ酶切得到0.6 kb左右片段(圖1)，該結果表明,不同分離株TgROP16的多態性無變化，作為弓形蟲分型的Marker基因應當謹慎使用。

2.3 TgROP16序列分析及進化樹的建立

9個樣品弓形蟲ROP16序列經DNA Star進行相似性比較，發現RH株和ME49株同源性最高,為100%，與豬源TgROP16同源性最低,為99.6%。環尾狐猴源TgROP16序列與豬源弓形蟲ROP16同源性最低,為99.4%，RH株最高和ME49株,均為99.8%。人源血TgROP16序列與PRU同源性最低,為99.5%。豬源TgROP16序列與VEG和人源分離株TgROP16差異性最大,為0.7,以上結果表明，弓形蟲在進化的過程中雖然感染宿主的種類繁多，但TgROP16基因的變異小、保守性高，不宜作為蟲株進化歷程和親緣關系的標記分子。5株標準株和4株國內分離株的ROP16序列進化樹分析(圖2)顯示，最大似然比為-3 170.349 9。

3 討論

人和動物的弓形蟲感染在世界范圍內呈流行趨勢。人可以通過攝入含有弓形蟲組織包囊的未熟肉類，含有弓形蟲卵囊的其他食物，或飲水引起感染。而通過位點酶切、PCR-RFLP和微衛星分型等分析手段，能夠將從北美和歐洲分離到的絕大多數人源和動物源性的弓形蟲蟲株劃入三個基因型譜系(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中。

ROP16也是由弓形蟲棒狀體分泌的一類絲氨酸——蘇氨酸激酶，在弓形蟲逃避宿主的免疫應答中起著非常重要的作用。弓形蟲侵入宿主細胞時分泌并釋放ROP16，后者最后被細胞核定位信號(nuclear local-ization signals，NLS)運輸至細胞核內，在那里定位并發揮作用[20]。然而很少有針對不同樣品弓形蟲ROP16的序列分析。PCR-RFLP已經被廣泛地應用于弓形蟲基因分型[21]，多分子標記的PCR-RFLP能更準確的鑒別寄生蟲，但是需要大量的時間[22]。相對而言，單個分子標記的PCR-RFLP更簡便和省時。5株標準株和4株國內分離株的弓形蟲ROP16序列均含有一個BamHⅠ酶切位點、一個HindⅢ酶切位點和一個XhoⅠ酶切位點(圖2)，酶切結果表明，弓形蟲ROP16序列存在多態限制性位點。本研究用TgROP16作為PCR-RFLP的標記分子，未能鑒別出傳統的弓形蟲Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。

注：M為marker；1～9分別為弓形蟲 RH株、ME 49株、PRU株、PTG株、VEG株、環尾狐猴源分離株、人源分離株1、人源分離株2、豬源分離株。Note: M is marker; 1～9 indicate T. gondii RH strain, ME 49 strain, PRU strain, PTG strain, VEG strain, ring-tailed lemur, human blood 1, human blood 2, and pig isolate, respectively.圖1 不同分離株ROP16基因PCR片段酶切結果Fig.1 PCR-RFLP analysis of ROP16 fragments of T. gondii isolates using restriction endonucleases

圖2 不同分離株ROP16序列系統進化樹Fig.2 Molecular phylogenetic anaylsis based on ROP16 sequence

根據傳統的弓形蟲分型，弓形蟲Ⅰ型有RH株，ME49、PRU、PTG屬于弓形蟲Ⅱ型，VEG則是弓形蟲Ⅲ型。本文以TgROP16序列為基礎進行分析，發現PTG不能被劃分為弓形蟲Ⅱ型，與用弓形蟲ROP38序列做進化樹結果一致[23]。環尾狐猴同VEG一樣被歸為弓形蟲Ⅲ型。人源血分離1和2分別被定義為弓形蟲Ⅲ型和Ⅱ型，與很多感染弱毒性弓形蟲株，癥狀不嚴重的病人一致。通過系統進化樹分析，發現豬源弓形蟲ROP16與其他蟲株的同源性較低，是否為一個新的弓形蟲分離株，需要進一步確認。

本研究所有樣品擴增出的弓形蟲ROP16序列全長均為2 124 bp。9種樣品ROP16序列差異很小，其中核苷酸突變率為0～0.7%，低于弓形蟲ROP47、ROP20、ROP17等序列[24-25]；對比氨基酸發現有19處不同。之前已經有許多關于弓形蟲ROP16的免疫保護性研究。Liu等[26]通過制備ROP16/GRA7 DNA疫苗評估了ROP16的免疫原性和反應原性。Yuan等[27]和Pan等[28]發現ROP16能誘導強烈的體液免疫和細胞免疫。這些結果表明：ROP16在不同分離株間非常保守，并能誘導強烈的免疫反應，是一個潛在的疫苗候選分子。