硫化氫在植物中抵御非生物脅迫機制的研究進展

李子瑋, 陳思蒙, 王發展, 張豪洋, 張莉, 許自成*

(1.河南農業大學煙草學院, 鄭州 450002; 2.江蘇中煙工業有限責任公司, 南京 210019)

硫化氫(H2S)在常溫常壓下是一種無色有“臭雞蛋”味的可燃氣體，可溶于水，不含水時pH 7.4，硫化氫陰離子(HS-)與H2S的比值為3∶1[1]。H2S在親脂溶劑中的溶解度是在水中的5倍[2]，所以能自由滲透脂質膜，被認為是繼一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)后的第3種植物內源性氣體信號分子。在動物和植物體中,低濃度的H2S具有多種生理功能。在動物體中，H2S影響心血管、神經元、免疫、腎、呼吸、胃腸、生殖、肝臟和內分泌系統[3]，H2S參與硫代謝營養調節，提高動物體內谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量，保護神經系統免受氧化傷害；與蛋白質活性位點的金屬中心相互作用，對人體心血管和神經功能產生積極影響[4]。在植物體中參與組成含硫防御系統，包括元素硫(S0)、H2S、GSH、植物螯合劑、各種次生代謝物和富硫蛋白等[5]。植物體對H2S濃度的變化具有一定調節功能，植物細胞中過多的H2S以氣體形式釋放到大氣中, 引發對病原體的防御響應機制，使植物細胞免受病原菌浸染[6]。本文結合國內外最新研究進展，綜述了H2S在植物體中通過基因調控、改變酶活性和蛋白質的表達、硫巰基化修飾、減輕氧化應激、與信號物質的互作等抵御非生物脅迫的作用機制，并對其作用機制進行了展望，以期為氣體信號分子對植物抵御非生物脅迫的調控研究提供多角度理論支持。

1 H2S產生機制

植物體既能通過葉片吸收大氣中的H2S，自身也具有H2S產生的機制。Rennenberg[7]在南瓜葉片中分別添加硫酸鹽、亞硫酸鹽、半胱氨酸(cysteine, Cys)和SO2，也發現有H2S釋放，證明使用不同的硫源存在不同的代謝途徑。L-半胱氨酸脫硫酶(L-cysteine desulfhydrase, LCD)和D-半胱氨酸脫硫酶(D-cysteine desulfhydrase, DCD)是最明確的可產生內源性H2S的酶。在植物細胞的細胞核中，LCD以L-半胱氨酸(L-Cys)為底物降解產生H2S、氨(NH3)和丙酮酸。在線粒體中，DCD降解D-半胱氨酸產生H2S[8]。

圖1 植物細胞內H2S的合成[11]Fig.1 Synthesis of H2S in plant cells[11]

2 H2S抵御非生物脅迫的機制

低濃度的外源H2S可以促進植物抵御各種非生物脅迫[12]。H2S可以緩解各種非生物脅迫損害，如鹽脅迫[13]、干旱和滲透脅迫[14-16]、冷脅迫[17]、熱脅迫[18]和重金屬脅迫[19]。

2.1 H2S通過基因調控抵御脅迫

2.1.1酶類相關基因 Fang等[20]研究表明，H2S通過調節與氨基酸和蛋白質相關的合成酶類基因，緩解Cr6+對擬南芥根系伸長的抑制作用。H2S上調半胱氨酸相關基因OASTLa、SAT1和SATS的表達水平，并延長SAT1基因和SATS基因的表達時間，促進H2S-Cys系統上調，該系統可提高植物螯合素(phytochelin，PCs)合成酶基因PCS1和PCS2的表達，增加植物螯合素的合成，減輕重金屬脅迫。另一種途徑同樣屬于基因調節，H2S上調金屬硫蛋白(metallothionein，MT)相關基因MT2A的表達，減緩Cr6+脅迫。Fang等[21]的后續研究結果同樣證明，H2S通過上調葡萄籽中MT3A基因和PCS基因的表達，增加與蛋白質相關的合成酶類PCs、MT等重金屬螯合劑基因的表達，緩解重金屬脅迫，而用H2S的合成抑制劑亞牛磺酸(hypotaurine, HT)處理此過程被阻斷。Hu等[22]研究表明，丁香酚通過上調油菜根系中BrLCD基因和BrDCD基因的表達及其酶活性，內源H2S含量增加，游離Cd2+顯著降低。若使用H2S的合成酶抑制劑——炔丙基甘氨酸 (propargylglycine, PAG)處理，油菜對鎘的耐受性降低。

Xie等[23]研究表明, 外源H2S調節另一種合成酶類血紅素氧合酶-1(HO-1) 基因的表達, 刺激內源CO產生，延緩赤霉素(gibberellin, GA) 誘導的小麥糊粉層細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD) ，而分別加入HO-1的兩種副產物一氧化碳(CO) 水溶液或膽紅素時，抑制作用部分逆轉，NaHS介導的PCD延緩作用消除。外源H2S誘導黃瓜HO-1轉錄本(CsHO1)、CsDNAJ-1和CsCDPKl/5基因的表達，CO能緩解HO-1抑制劑鋅原卟啉(zinc protoporphyrin, ZnPP) 對基因表達的抑制，說明H2S在誘導黃瓜不定根發生的過程中可能是通過HO-1/CO信號系統產生的作用[24]。

H2S還可通過調控氧化還原酶類基因，緩解鋅脅迫。Liu等[25]研究表明，H2S上調抗氧化酶相關基因CAT2的表達，下調氧化酶相關基因CSD、FSD和pAPX的表達，使過量的H2O2還原，減輕鋅誘導的氧化應激，緩解鋅脅迫。

2.1.2植物激素相關基因 H2S調節植物激素生物合成相關基因(NCED1/6、GA2ox7、IAA氧化酶、ACO、脂氧合酶)和TFs(AP2)的表達來改變激素水平[26]。茉莉酸(jasmonic acid, JA) 是高等植物的內源生長調節劑，誘導氣孔關閉，作用于H2S信號的上游，H2S調節與JA生物合成相關的基因(NtLOX、NtOS、NtAOC和NtOPR) 的轉錄，改變激素水平提高抗旱能力[27]。H2S與乙烯相互作用，提高香蕉抗氧化基因MaAPX和抗病基因MaPAL的表達水平，提高信號轉導基因MaETR、MaERS1、MaERS2和MaERS3的表達水平，說明H2S改變乙烯含量提高抗氧化等能力，通過調節自身激素水平響應非生物脅迫[28]。王韜遠等[29]研究表明，在擬南芥lcd突變體中，ABA(abscisic acid)受體編碼基因GCR2和GTG1的表達水平顯著增強，而H2S供體NaHS處理顯著降低基因表達，證明外源H2S增強了ABA誘導的氣孔關閉。

2.1.3信號分子相關基因 低溫脅迫誘導植物內源H2S信號的產生，這種信號可被外源施加的Ca2+和H2S增強，使Ca2+信號轉導相關基因CaM、CIPK5的mRNA表達上調，增強植物對冷脅迫的抗性[30]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)最早發現于苜蓿，參與生長發育和各種刺激信號傳導。MAPK相關基因MPK4在擬南芥的保衛細胞和煙草的遠軸表皮中均有表達，參與氣孔運動，H2S作用于MPK4基因下游，抑制擬南芥氣孔開放，增加耐旱性[31]。杜鑫哲等[32]研究表明，H2S上調基因MPK4的表達水平，共同調控冷脅迫響應基因ICE1、CBF3、COR15A和COR15B的表達，提高擬南芥在冷脅迫下的耐受性。香蕉MAPK1基因屬于MAPK基因家族，參與香蕉逆境脅迫應答[33]，推測香蕉內源H2S通過上調MAPK1基因的表達抵御冷脅迫。

2.1.4RNA相關基因 miRNA (microRNA)是生物體內普遍存在的小分子RNA, 由內源基因編碼于轉錄后，通過介導靶mRNA降解或翻譯抑制來調控基因表達, 是真核細胞基因表達的重要調控機制。Shen等[34]研究表明，H2S能有效調控miRNA相關基因Mir167a、Mir167c、Mir167d、Mir393a和Mir396a的轉錄水平, 提高擬南芥對干旱脅迫的耐受力。

2.1.5其他與逆境相關的基因 低濃度H2S通過上調病程相關基因(MIR-393、MIR393b)的表達，改善次級代謝產物氨基酸、有機酸、糖、糖醇和芳香胺的含量，提高植物耐受力[35]。H2S上調番茄幼苗側根生長相關的細胞循環相關基因SICDKA1、SICYCA2、CYCD3、CDKA1，及生長素響應因子基因ARF4、ARF7， 證明H2S與吲哚乙酸(indoleacetic acid, IAA)共同誘導番茄側根的形成[36]。Garcia-mata等[37]用NaHS預處理鳳仙花，氣孔孔徑減小，干旱相關基因(DREB2A/B、CBD29A)表達增加，表明提高了抗旱性。

2.2 H2S通過調控蛋白質表達抵御非生物脅迫

H2S信號分子調控冷脅迫響應基因CBFs的表達，基因CBF調控防凍蛋白COR (cold response) 的表達，進而增加植物對冷脅迫的抗性[37]。H2S通過調節生物鐘相關基因CCA1和PRR9的表達，進而調控下游靶標CBFs基因，提高防凍蛋白活性，增加擬南芥對冷脅迫的耐受性。H2S促進與鋅吸收有關的重要轉運體ZRT、IRT序列的表達，抑制編碼ZIP家族轉運蛋白，下調對鋅的吸收[38]。

2.3 H2S通過改變酶活性抵御非生物脅迫

NaHS處理可提高玉米幼苗中海藻糖-6-磷酸酸酶(treha-lose-6-phosphate phosphatase, TPP)的活性, 從而提高海藻糖的含量增強耐熱性[39]。NaHS供體提高Delta(1)-吡啶-5-羧酸合成酶活性，降低脯氨酸脫氫酶活性誘導玉米幼苗脯氨酸含量的增加，減輕丙二醛(malondialdehyde, MDA)的積累，提高熱脅迫下玉米幼苗的成活率[40]。外源H2S提高β-淀粉酶活性，促進黃瓜種子的萌發[41]。三磷酸腺苷酶(adenosine-triphosphate, V-ATPase)是液泡中產生質子梯度的關鍵酶，鎘脅迫下酶的活性受到抑制，外源H2S促進ATP水解和質子運輸，對V-ATPase的合成產生積極影響，恢復液泡膜內外質子梯度濃度[42]。Dai等[43]研究表明，低濃度的NaHS降低金屬脅迫下小麥葉綠體中MDA和過氧化氫(H2O2)的含量，濃度為0.8 mmol·L-1時抗氧化酶活性升高的效果最明顯。

H2S對包括重金屬毒性在內的不同非生物脅迫誘導的氧化應激具有重要作用。H2S增加基本元素氮(N)、磷(P)和鉀(K)的吸收，平衡鎂(Mg)、錳(Mn)、銅(Cu)、鐵(Fe)等礦物質營養元素。H2S與根瘤菌對減少苜蓿中重金屬的積累具有協同作用[44]，增加植物營養元素的吸收，與重金屬元素產生競爭吸收，降低H2O2、ROS和MDA的含量，使SOD、POD、APX、CAT等抗氧化酶的活性增加，減輕氧化脅迫，增加地上和地下部干重，提高苜蓿對土壤中重金屬的耐受性。

2.4 H2S通過平衡電解質抵御非生物脅迫

作物生長發育易受鹽堿地的影響而減產，因此，維持植物體K+/Na+平衡對于適應高鹽環境至關重要。H2S在離子穩態中發揮作用，有效降低植物在鹽脅迫下的中毒癥狀。朱會朋[45]研究發現，50 mol·L-1NaHS處理胡楊(Populuspopularis) 明顯緩解鹽脅迫，H2S一方面通過降低質膜去極化，抑制K+外流，另一方面通過上調質膜H+泵，為Na+/H+跨膜逆向轉運提供質子濃度梯度，有效維持植物體在鹽脅迫下的離子穩態。Deng等[46]通過使用CaCl2(非選擇性陽離子通道的抑制劑-NSCCs)、TEA+(一種低親和力K+轉運蛋白的抑制劑)或阿米洛利(一種對鹽敏感的抑制劑-SOS1)，研究證明NSCCs和SOS1通道是H2S降低小麥幼苗中Na+濃度的主要途徑。表明H2S通過維持胞內外電解質平衡，抵御非生物脅迫。

2.5 H2S通過改變重金屬元素的形態抵御重金屬脅迫

Yang等[47]在柳樹根部噴施NaHS溶液，研究發現，鎘在葉片和根中總的吸收水平基本不變，其中不溶性鎘的比例增加，可溶性鎘的比例下降，證明外源H2S通過改變鎘的物理形態降低植物中毒癥狀。鉻存在幾種氧化態，其中化學性質最穩定的兩種形式是Cr3+和Cr6+。Cr6+脅迫抑制擬南芥根系伸長，推測信號分子H2S可能通過提高Cr3+/Cr6+比值，降低氧化態的重金屬毒性。

銅(Cu)是植物生長發育必需的微量營養元素，參與植物細胞中電子傳遞鏈、蛋白質轉運和催化酶等生化反應。但銅作為氧化還原活性的過渡金屬，過量銅損傷根系表皮，減少根毛的數量和長度。植物雖能分泌蘋果酸、檸檬酸等有機酸來改善銅的毒性，但植物自身無法調節過量的銅產生的毒性。低濃度NaHS預處理可促進Cu與體內游離氨基酸的接觸，抵消Cu對小麥種子萌發的抑制作用[48]。

2.6 H2S通過蛋白質的硫巰基化修飾抵御非生物脅迫

硫巰基化修飾(S-sulfhydrylation)是信號分子H2S在植物體中發揮生物學活性的重要途徑。H2S對 Cys殘基進行硫巰基化修飾，Cys-SH基團轉化為Cys-SSH過硫基團，直接調控蛋白質的活性[49]。H2S通過肌動蛋白的S-硫化作用，引起肌動蛋白細胞骨架變化，抑制肌動蛋白聚合。證明外源H2S調節肌動蛋白動力學，并影響根毛生長[50]。外源H2S促進擬南芥中APX硫巰基化，提高APX的活性[51]。

2.7 H2S通過維持GSH系統穩態抵御非生物脅迫

還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽 (GSH/GSSG)是反映細胞氧化還原狀態的重要參數，在豆科植物苜蓿中，GSSG比GSH高約17倍。Lai等[52]研究表明，隨著NaCl處理濃度的升高，誘導苜蓿幼苗L-CD活性和內源H2S含量的增加，H2S作為內源調節劑有效調控抗氧化酶活性，提高GSH/GSSG比值，增強AsA-GSH循環代謝，重建氧化還原平衡。Mostofa等[53]研究表明，NaHS預處理可恢復鹽脅迫下抗壞血酸(ascorbic acid, AsA) 含量的損失，并進一步提高GSH含量，維持AsA/DHA和GSH/GSSG比值；平衡礦物質元素含量，降低Na+的吸收和Na+/K+的比值，同時，內源H2S含量增加，保護葉綠素、類胡蘿卜素和可溶性蛋白免受鹽脅迫損傷。Upadhyaya等[54]研究表明，NaHS上調水稻植株中甘氨酸(glycine, Gly) 相關酶Gly I和Gly II的活性，進而維持GSH系統穩態，減緩細胞甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)和ROS的毒性。Singh等[55]用砷脅迫處理豌豆幼苗，外源施加H2S提高內源NO水平，NO作為第二信使，增強AsA-GSH循環代謝，平衡氧化還原狀態，減少ROS介導的大分子損傷，緩解過氧化對植物的損害。

3 H2S與其他信號物質的互作

3.1 H2S與Ca2+的互作

Ca2+作為通用的第二信使，是植物中重要的轉導和調節因子。Ca2+結合蛋白感知Ca2+的快速增加并傳遞特異性信號，植物可通過此方法產生適應性反應。H2S與Ca2+具有協同作用，H2S部分貢獻由Ca2+活化的抗氧化系統，減輕金屬鉻脅迫。Ca2+和CaM調控煙草細胞內源H2S的積累，通過調節抗氧化系統的活力誘發耐熱性的形成[56]。

3.2 H2S與植物激素的互作

高等植物的生理活動處于復雜的信號網絡中，不同通路間存在不同的相互作用，共同抵御非生物脅迫。H2S改變不同信號物質的平衡，調節植物生長和耐受性。水楊酸(salicylic acid, SA) 是一種酚類信號物質，作用于H2S上游，參與植物對逆境脅迫的響應，SA和NaHS預處理可增強玉米幼苗耐熱性[57]。外源H2S作用于IAA上游，促進IAA和NO共同介導的不定根形成。

氣孔開閉對控制植物氣體交換起重要作用, 控制光合作用所需CO2的吸收和蒸騰作用水分的散失，H2S通過與植物激素相互作用，調節氣孔關閉，增強植物的耐旱性。外源JA增強蠶豆葉片保衛細胞中LCD和DCD的活性，提高內源H2S水平，H2S合成抑制劑降低了JA誘導的氣孔關閉，說明H2S參與JA誘導的氣孔關閉。Scuffi等[58]研究表明，H2S作用于NO上游，缺乏內源H2S時，NO含量降低，導致ABA合成受阻，抑制氣孔關閉。鹽脅迫誘導信號分子H2O2產生，H2O2來源于NADPH氧化酶、細胞壁過氧化物酶和POA途徑，H2O2提高H2S含量，ABA合成增加，促進蠶豆氣孔關閉，證明H2S可能在H2O2的下游，參與氣孔關閉信號轉導，與激素的互作誘導蠶豆氣孔運動[59-60]。

3.3 H2S、MAPK與NO信號分子的互作

大量研究已證實，H2S和NO在調節植物生長和發育中的相互作用。NO參與激活MAPK信號傳導途徑，參與植物防御，硝酸還原酶依賴性NO的產生與番茄中H2S誘導的硝酸鹽脅迫耐受性有關[61]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯是真核生物中通用的信號傳導方式，在植物的許多生理和生物化學過程中起至關重要的作用。Xu等[62]從黃瓜中克隆了名為CsNMAPK的MAPK基因，證明了在硝酸鹽脅迫下，H2S通過調節抗氧化酶活性參與MAPK/NO信號傳導，對黃瓜幼苗起到保護作用，且H2S、MAPK與NO在黃瓜根系中具有交互作用。CsNMAPK的過表達增強了其硝酸鹽脅迫耐受性。如圖2所示，以NaHS作為H2S的供體，示意H2S、CsMAPK和NO參與減輕黃瓜幼苗根系氧化損傷的作用[62]。

圖2 H2S、MAPK與NO在黃瓜根系中抵御硝酸鹽脅迫的交互作用[62]Fig.2 Interaction of H2S, MAPK and NO against nitrate stress in cucumber roots[62]

在硝酸鹽脅迫下，施加H2S供體NaHS促進基因CsMAPK的表達，而用H2S抑制劑PAG和HT降低了基因CsMAPK的表達，導致黃瓜根系耐鹽性降低。進一步推測，硝酸鹽脅迫下NO含量較低，H2S供體NaHS提高NO含量，激活了CsMAPK的表達，而使用H2S抑制劑或基因表達抑制劑PD98059降低NO含量，下調基因CsMAPK的表達，從而降低黃瓜幼苗對硝酸鹽脅迫的耐受性。

3.4 H2S與信號分子甲基乙二醛的互作

甲基乙二醛(MG)在鹽脅迫中可迅速增加2～6倍，成為一種脅迫標志。Kaur等[63]通過轉錄組分析，用濃度為10 mmol·L-1的MG處理水稻幼苗16 h后，共1 685個基因的表達發生了1.5倍以上的變化，大部分涉及響應MG和干旱等脅迫的信號轉導過程，MG響應元件(methylglyoxal-response element, MGRE) 發生10倍以上的轉錄變化，表明外源H2S誘導信號分子MG的表達，抵御干旱脅迫。Christou等[64]研究發現，NaHS可取代熱激，通過增加草莓幼苗內源H2S的積累，同樣可誘導HSP70、HSP80和HSP90基因的表達，表明外源H2S可激活MG脫毒系統，增強植物耐旱性。因此，H2S在植物信號轉導過程中，與信號分子的互作觸發分子機制，提高植物在逆境脅迫中的耐受能力。

在植物體中，H2S通過直接參與基因調控、改變酶活性和蛋白質的表達、硫巰基化修飾、與信號物質的互作等過程，在植物抵御非生物脅迫中發揮重要的作用，為今后更深入研究H2S的抗逆性作用機理提供理論參考，具有重要的科學意義和農業指導意義。

4 展望

H2S的功能貫穿于植物生長發育的整個過程, 尤其在植物響應非生物脅迫方面發揮至關重要的作用。目前，H2S的研究仍存在一些不足，今后的研究可以考慮從以下幾個方面深入探索：①需要進一步研究H2S在植物信號轉導過程中的直接靶點和上下游級聯反應,還需要深入闡明H2S與其他信號分子之間互作關系網；②植物生長發育的過程取決于不同激素的比例，H2S可能是協調植物激素相互作用的中間物，其作用機理尚未明確；③結合基因技術，嘗試培育抗逆作物新品種；④需要深入探索植物體內與H2S合成相關基因突變體的篩選，以及H2S熒光探針的應用。