不同地理種源北柴胡種子性狀及植株生長(zhǎng)分析

戚文濤， 李劍超， 王晨， 羅容,2， 劉長(zhǎng)利,2*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)絡(luò)病研究北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

傘形科柴胡屬(BupleurumL.)植物主要分布在北半球溫帶、亞熱帶地區(qū)，約2 500種，《中國(guó)植物志》記載我國(guó)共有41種17變種7變型，其中藥用25種[1-3]。柴胡作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有和解表里、疏肝解郁、升陽舉氣功效。《中國(guó)藥典》規(guī)定柴胡為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)和狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)的干燥根，習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”[3]。目前，柴胡已被中國(guó)和日本納入國(guó)家藥典，同時(shí)中國(guó)和韓國(guó)將其列為常用藥用植物，因其重要的藥用價(jià)值，柴胡需求量急劇增加，人工種植是解決需求的必然選擇[4-6]。北柴胡作為柴胡藥材的主要來源，在我國(guó)東北、華北、華中及華南等地均有分布，并且在大部分地區(qū)已有引種栽培，在甘肅、陜西、山西、河南及黑龍江等地形成家種產(chǎn)區(qū)。由于人工引種來源廣而復(fù)雜，各個(gè)種源地自然環(huán)境差異顯著，種植技術(shù)和管理模式各不相同，致使北柴胡種子成活率較低，藥材性狀差別較大、質(zhì)量不穩(wěn)定和藥效不可控，嚴(yán)重影響了柴胡的臨床用藥安全和療效，所以加強(qiáng)不同種源地北柴胡種子種苗及植株藥材研究，規(guī)范北柴胡引種、栽培和藥材加工迫在眉睫。

中藥質(zhì)量控制和提升是促進(jìn)中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的關(guān)鍵，其中規(guī)范中藥材種子種苗和種植技術(shù)是基礎(chǔ)，也是中醫(yī)藥行業(yè)面臨的主要難題。目前，針對(duì)北柴胡種子儲(chǔ)藏條件、萌發(fā)特性、栽培方法及組織培養(yǎng)等已有大量研究報(bào)道[6-11]，對(duì)不同產(chǎn)地中藥材種子種苗及植株藥材差異比較也有相關(guān)報(bào)道，如楊旭等[12]對(duì)不同產(chǎn)地43份桔梗種子地理變異、種子特性及幼苗生長(zhǎng)狀況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)安徽亳州及安徽太和的桔梗種源適合在浙江富陽等地區(qū)栽培；童應(yīng)鵬等[13]對(duì)中國(guó)8省9產(chǎn)地栽培薏苡種子性狀變異原因進(jìn)行了分析和研究，但迄今為止，對(duì)不同種源北柴胡種子的質(zhì)量評(píng)價(jià)及引種后植株適應(yīng)性研究還少有報(bào)道。本文對(duì)不同種源北柴胡種子性狀及植株生長(zhǎng)狀況進(jìn)行研究，揭示地理、氣候等生態(tài)環(huán)境因子對(duì)北柴胡種子特性和植株生長(zhǎng)狀況影響，為北柴胡優(yōu)質(zhì)種源篩選、規(guī)范引種栽培提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料(表1)于2018年3月至5月收集于北京、黑龍江大慶、河南洛陽、四川綿陽、山東濟(jì)南等7省區(qū)10個(gè)產(chǎn)地，其中，中柴2號(hào)(B13)和川北柴1號(hào)(B14)均為當(dāng)?shù)剡x育品種。經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院劉長(zhǎng)利副教授鑒定為植物柴胡(B.chinense)雙懸果的分果(種子)。所有材料種植于山東省濟(jì)南市曹范鎮(zhèn)柴胡種植基地，2019年7月23日采收。

表1 供試北柴胡種子產(chǎn)地基本情況Table 1 Basic information on the origin of B. chinense seeds

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取及PCR擴(kuò)增 供試種子樣品用75%酒精棉擦拭表面，挑選籽粒飽滿的種子10粒約10 mg，置于2.0 mL 離心管中，于液氮中冷凍干燥，用混合型球磨儀研磨1 min(36 00 r·min-1)，利用新型植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取樣品基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為ITS2F：5’-A T G C G A T A C T T G G T G T G A AT-3’；ITS2R：5’-G A C G C T T C T C C A G A C T A C A AT-3’。PCR擴(kuò)增體系20 μL，包括2× KAPA HiFi HotStart ReadyMix酶(美國(guó)Kapa Biosystems公司) 10.0 μL，正向引物和反向引物各 0.6 μL，基因組DNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃變性3 min；98 ℃變性20 s；55 ℃退火15 s；72 ℃ 延伸20 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2種子性狀指標(biāo)測(cè)定 隨機(jī)選取每批供試種子樣品30粒，用體視顯微鏡(SteREO Discovery.V8，ZEISS)以及游標(biāo)卡尺(電子數(shù)顯卡尺，LINKS)進(jìn)行測(cè)量和觀察，記錄供試種子的顏色、形狀及長(zhǎng)、寬、厚等特征，并拍照；精密稱取供試種子樣品4 g，撿出凈種子、雜質(zhì)及其他植物種子，重復(fù)操作3次，分別計(jì)算樣品的凈度；取每份供試樣品種子各500粒，精密稱其重量，重復(fù)3次，計(jì)算種子樣品千粒重；采用高溫烘干減重法進(jìn)行種子樣品含水量測(cè)定，先將樣品盒(鋁盒)烘干(130 ℃，1 h)，放入干燥器中冷卻30 min。從充分混勻的北柴胡種子樣品中隨機(jī)稱取2份種子(5.0 g·份-1)，再將樣品盒連同種子進(jìn)行烘干(130 ℃，1.5 h)，待鋁盒冷卻后稱量，并根據(jù)烘干后種子失去的重量計(jì)算種子含水量。

含水量=(減少的重量/供試種子的重量)×100%

1.2.3植株性狀指標(biāo)測(cè)定 采收不同產(chǎn)地的柴胡植株15株，測(cè)量植株的株高、莖粗(上、中、下部)、根粗、根長(zhǎng)及根的干重等指標(biāo)，并觀察記錄植株的外觀性狀，包括葉、莖及根等特征。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 對(duì)種子樣品ITS2序列用SeqMan7.0軟件進(jìn)行剪切和拼接，去除引物及低質(zhì)量區(qū)，并基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除兩端5.8 S和28 S 區(qū)段即可獲得核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)間隔區(qū)序列，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載柴胡屬包括北柴胡在內(nèi)的其他種ITS2序列，對(duì)所有ITS2序列用MEGA7.0進(jìn)行多重序列比對(duì)并利用鄰接法(neighbour-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步鑒定收集種子樣品的基原。

1.2.5數(shù)據(jù)分析 用Excel表建立北柴胡種子和植株的數(shù)據(jù)文檔，并用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析、種子及植株性狀與生態(tài)環(huán)境因子的相關(guān)性分析(北京和四川綿陽均為選育品種，排除二者后進(jìn)行相關(guān)性分析)，并采用歐式距離法對(duì)中國(guó)7省區(qū)10產(chǎn)地的北柴胡種子進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源北柴胡種子性狀比較分析

從圖1可以看出，不同種源的北柴胡種子外觀特征相似，果實(shí)均為雙懸果，顏色為棕褐色或棕黑色，頂端花柱基宿存，基部圓鈍；分果(種子)呈卵形、矩圓形或橢圓形，兩端壓扁，背部略拱凸，向合生面彎曲，表面有5條主棱(中間背棱1條，兩邊側(cè)棱各1條，兩側(cè)棱和背棱間各有中棱1條)，棱槽處有縱皺紋，合生面中央有果柄痕。不同產(chǎn)地北柴胡種子的形態(tài)指標(biāo)均存在顯著性差異(P<0.05，表2)。北京選育的北柴胡品種中柴2號(hào)(B13)和四川綿陽的川北柴1號(hào)(B14)相較于其他種源地的北柴胡種子均比較長(zhǎng)且寬，千粒重較大；其次為山東濟(jì)南的北柴胡種子，千粒重較大，種子較長(zhǎng)且寬；千粒重最小的為甘肅天水北柴胡種子。種子長(zhǎng)寬比結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，山東濟(jì)南北柴胡種子比值最大，比較細(xì)長(zhǎng)，黑龍江大慶產(chǎn)種子比值最小，均比較短寬。，山東萊蕪產(chǎn)地的北柴胡種子含水量最大，黑龍江大慶產(chǎn)地的種子含水量最小。不同種源地的北柴胡種子均或多或少摻有雜質(zhì)或其他種子，影響種子的純度和質(zhì)量。

表2 不同種源北柴胡種子性狀多重比較Table 2 Multiple comparisons of B. chinense seed traits

圖1 部分北柴胡種子和對(duì)應(yīng)植株生長(zhǎng)性狀Fig.1 Morphologica characteristics of partial B.chinense seeds and plants

2.2 種子性狀與生態(tài)環(huán)境因子相關(guān)性分析

對(duì)北柴胡種子的外觀性狀與產(chǎn)地的地理、氣候等生態(tài)環(huán)境因子的相關(guān)性分析表明(表4)，種子的寬度、厚度及千粒重與經(jīng)度呈顯著正相關(guān)，與緯度的相關(guān)性不顯著，排除降水量和溫度差的影響，經(jīng)度越高，寬度和厚度越大，種子的千粒重越大，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.753、0.666和0.633；種子的含水量與產(chǎn)地的年降雨量呈顯著正相關(guān)，降雨量越大則種子的含水量越高，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.745。

2.3 不同種源北柴胡植株生長(zhǎng)狀況比較

對(duì)植株的株高、根莖等指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)行方差分析表明，植株高度、莖(下、中、上)粗、根直徑、根干重及根長(zhǎng)均存在顯著性差異(P<0.05，表3)。對(duì)植株外觀性狀觀察發(fā)現(xiàn)，山東濟(jì)南產(chǎn)地北柴胡基部莖多分3～8枝且葉片較寬長(zhǎng)，其他產(chǎn)地北柴胡多為莖單一且葉片較狹長(zhǎng)；選育品種川北柴1號(hào)(B14)和中柴2號(hào)(B13)的植株顏色較其他產(chǎn)地深，呈現(xiàn)深綠色，且培育品種的花期和果期較其他產(chǎn)地較早，二者植株7月份均結(jié)出成熟的雙懸果，部分產(chǎn)地植株還處于花蕾期。從表3可以看出，河南三門峽和陜西商洛產(chǎn)地北柴胡植株比較粗高，選育品種植株相對(duì)比較矮小；山東濟(jì)南產(chǎn)北柴胡主根粗大且長(zhǎng)，根莖的干重相對(duì)于其他產(chǎn)地要高很多，推測(cè)其為試驗(yàn)田本地品種更適宜生長(zhǎng)，生長(zhǎng)年份較其他產(chǎn)地長(zhǎng)所致，其次為黑龍江大慶產(chǎn)地和中柴2號(hào)植株的根莖比較粗大且較重，且三個(gè)產(chǎn)地的根莖側(cè)根均較多。

表3 不同種源北柴胡植株生長(zhǎng)狀況多重比較Table 3 Multiple comparisons of growth status of different B. chinense

2.4 北柴胡植株性狀與生態(tài)環(huán)境因子相關(guān)性分析

對(duì)北柴胡植株性狀與產(chǎn)地的地理、氣候等生態(tài)環(huán)境因子的相關(guān)性分析(表4)表明，植株的莖粗細(xì)與緯度呈顯著正相關(guān)，緯度越高，植株的莖則較粗，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.638和0.779；根莖干重與年均日照呈顯著正相關(guān)，日照越長(zhǎng)，根莖干重則越重，說明日照有助于植株根莖生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物積累，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.641。

表4 北柴胡種子性狀、植株性狀與地理生態(tài)因子相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficient between B.chinense seed/plant traits and geographical ecological factors

2.5 北柴胡種子質(zhì)量與植株生長(zhǎng)狀況的相關(guān)性分析

北柴胡種子千粒重與其長(zhǎng)、寬、厚呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.707、0.771和0.701，說明長(zhǎng)寬厚均比較大的種子其千粒重越大。種子千粒重與根長(zhǎng)、根干重呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.711和0.643, 說明千粒重較高的種子含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可為幼苗根莖生長(zhǎng)提供更多營(yíng)養(yǎng)，從而影響植株的根莖生長(zhǎng)，根莖較長(zhǎng)且干重較大。北柴胡植株的高度、莖粗與根莖的長(zhǎng)度、干重有一定的相關(guān)性(P<0.05)，植株越粗大，分枝越多，其光合作用效率越強(qiáng)，對(duì)根生長(zhǎng)影響就越顯著。根莖質(zhì)量與根長(zhǎng)的相關(guān)性極顯著，相關(guān)系數(shù)為0.856(P<0.01)，而與根莖直徑的相關(guān)性則并不顯著，說明北柴胡的根系在生長(zhǎng)發(fā)育期間主要完成向下生長(zhǎng)過程，其直徑增加將在縱向生長(zhǎng)過程完成后進(jìn)行。

2.6 不同產(chǎn)地北柴胡聚類分析

2.6.1ITS2序列聚類分析 基于北柴胡種子的ITS2序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹(圖2)。從聚類樹上可以明顯看出，傘形科防風(fēng)、當(dāng)歸和柴胡屬其他物種分別單獨(dú)聚類，說明它們與柴胡屬物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)易區(qū)分；柴胡屬內(nèi)5個(gè)物種單獨(dú)聚為5小支，且各分支支持率較高，具有良好的單系性，供試的13批北柴胡種子均聚在北柴胡一支，進(jìn)一步說明其均為北柴胡種子。

2.6.2歐氏距離聚類分析 根據(jù)北柴胡種子千粒重、含水量、長(zhǎng)度、寬度、厚度、種子長(zhǎng)寬比及植株的株高、根直徑、根長(zhǎng)、根干重10個(gè)指標(biāo)，采用歐式距離法對(duì)中國(guó)的7省區(qū)10個(gè)地區(qū)的北柴胡種子進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。從圖3可知，10產(chǎn)地的栽培北柴胡種子可以聚為4類，中西部地區(qū)的甘肅定西、甘肅天水、陜西商洛、河南三門峽及河南洛陽聚為一類，東北地區(qū)的黑龍江大慶聚為一類，中東部地區(qū)的山東濟(jì)南、山東萊蕪聚為一類，選育品種的北京和四川綿陽聚為一類。中西部地區(qū)的北柴胡種子植株較高，主根較短且干重小，種子千粒重居中；東北地區(qū)北柴胡種子千粒重較小，植株較長(zhǎng)且干重較大；中東部地區(qū)北柴胡種子較大，千粒重較大，植株根系發(fā)達(dá)，較長(zhǎng)且分枝較多；北京和四川綿陽均為選育品種，種子較大且均勻，千粒重均較大，植株較矮小，主根較長(zhǎng)，但根莖的干重差別較大，這與川北柴1號(hào)生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，在北方地區(qū)生長(zhǎng)有一定影響。

圖3 不同種源北柴胡(歐氏距離)聚類分析Fig.3 Cluster of B.chinense (Euclidean distance) from different locations

2.6.3兩種聚類分析結(jié)果比較 對(duì)比NJ樹聚類和歐式距離聚類結(jié)果可知，ITS2序列系統(tǒng)進(jìn)化樹可以準(zhǔn)確鑒別種子或植株的基原，但不可以對(duì)產(chǎn)地和性狀進(jìn)行區(qū)分；歐式距離聚類分析則可以根據(jù)種子或植株的性狀特征進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分，但不能直接反映出種子或植株的基原。

注： B1、B3等為北柴胡種子,編號(hào)同表1。Note：B1 and B3 etc. are code of B.chinense seed as Table 1.圖2 ITS2序列NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 NJ tree based on the ITS sequences

3 討論

3.1 不同種源地北柴胡種子和植株性狀的顯著差異性

不同種源北柴胡種子雖然外觀特征極其相似，但是形態(tài)和性狀指標(biāo)均存在顯著性差異，說明我國(guó)北柴胡種子性狀存在較大的變異，遺傳信息豐富。選育品種中柴2號(hào)(B14)和川北柴1號(hào)(B14)籽粒飽滿，凈度較高，種子千粒重較大，質(zhì)量?jī)?yōu)于其他產(chǎn)地北柴胡種子。對(duì)其他非選育北柴胡種子研究發(fā)現(xiàn)，山東濟(jì)南的北柴胡種子比較細(xì)長(zhǎng)且千粒重最大，黑龍江大慶產(chǎn)北柴胡種子較短寬且千粒重最小；不同產(chǎn)地的北柴胡種子中均或多或少摻有雜質(zhì)或其他種子，且種子大小和飽滿度不一，影響種子純度和質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，北柴胡種子的長(zhǎng)、寬、厚及千粒重等指標(biāo)的變化主要是由于經(jīng)度的改變，隨著經(jīng)度的升高，海拔逐漸減低，降水量等因子逐漸增加，種子含水量也逐漸增加。

不同種源北柴胡植株地上部分和地下部分的生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著性差異。其中山東濟(jì)南產(chǎn)地北柴胡基部莖多分3～8枝且葉片較寬長(zhǎng)，其他產(chǎn)地北柴胡多為單一莖且葉片狹長(zhǎng)；川北柴1號(hào)和中柴2號(hào)等選育品種的植株呈現(xiàn)深綠色，二者的花果期較其他產(chǎn)地較早。北柴胡植株莖的直徑很大程度上是由緯度的改變引起，隨著緯度的降低，熱量因子逐漸增加，溫度逐漸升高。根莖干重則受產(chǎn)地年均日照的影響，日照越長(zhǎng)，干重越大。因此在北柴胡栽培引種時(shí)，應(yīng)按照引種地的實(shí)際地理氣候情況，盡量選擇生態(tài)環(huán)境因子相近的地區(qū)作種源區(qū)進(jìn)行引種，以保證引種后北柴胡種子有較高的成活率和良好的生長(zhǎng)狀況。

3.2 影響北柴胡種子性狀差異的因素

相關(guān)分析表明，北柴胡種子性狀和質(zhì)量受產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境因子的影響，呈現(xiàn)顯著性差異。我國(guó)柴胡資源分布廣泛，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)藥用柴胡來源多達(dá)25種8變種3變型，包括北柴胡的變種煙臺(tái)柴胡(B.chinenseDC. f.vanheurckii(Muell. -Arg.)和百花山柴胡(B.chinenseDC. f.octoradiatum(Bunge)等[14]，北柴胡豐富的遺傳信息和遺傳多樣性影響種子和植株的性狀資源[15-16]。同時(shí)，各地栽培北柴胡的品種多是從山谷中野生資源引種、馴化、選育出來，在逐步遷移、馴化和選擇過程中，人為篩選出許多地方品種，各地栽培密度，播種時(shí)間及灌溉施肥等方式也各不相同，造成了北柴胡種子和植株的性狀差異。以上結(jié)果表明，北柴胡種子性狀受產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境因子、遺傳信息和人工栽培方法等因素的影響。