外源鉻對延胡索生理指標及抗氧化系統變化的影響

盛笠, 程福龍, 余順慧, 王柏慧, 盧增輝, 潘杰*

(1.重慶三峽學院, 三峽庫區水環境演變與污染防治重慶市重點實驗室, 重慶 404199; 2.南京信息工程大學環境科學與工程學院, 南京 210044;3.貴州大學, 國土資源部喀斯特環境與地質災害重點實驗室, 貴陽550025;4.重慶市萬州區生態環境監測站, 重慶 404100)

重金屬鉻(Cr)是環境污染中最危險的五類物質之一，其在土壤中大量存在時，對生態環境造成了嚴重的影響[1]。外源重金屬Cr6+被植物體吸收后，植物體內將產生大量的活性氧(reactive oxygen, ROS)，從而造成生物分子的氧化損傷[2]。因此，植物中有一套包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、抗壞血酸(ascorbate, AsA)在內的抗氧化系統來清除ROS，以保護植物細胞不受氧化損傷[3]。

已有學者研究了植物抗氧化系統在鎘、鉛、鋅等重金屬脅迫下的應激變化趨勢及其作用機制[4]；高揚等[5]研究發現，在Pb、Cd復合脅迫下龍葵內SOD、POD活性隨重金屬處理濃度的升高逐漸升高，而GSH含量逐漸減少，而其葉生物量顯著減少，根莖生物量則在低濃度處理下減少不明顯；何潔等[6]研究表明，隨Zn脅迫含量升高，翅堿蓬發芽率、苗高、苗重均降低，SOD、POD活性也呈下降趨勢，CAT活性呈先升后降趨勢。延胡索(Corydalisyanhusuo)塊莖是常用中藥材，分布于安徽、江蘇、浙江等地，目前在重慶萬州地區大量引種栽培。但目前關于鉻處理下延胡索抗氧化系統變化與延胡索生長、生理之間關聯的研究相對較少。因此，本試驗選用延胡索為受試材料，研究了鉻處理下延胡索植株生理指標變化，進而探究延胡索抗氧化系統的應激變化和作用機制，以期為重金屬鉻對中藥材毒理學研究及延胡索種植環境要求提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

延胡索塊莖，2017年10月購于浙江省東陽市農業局，在4 ℃條件下冷藏儲存備用。試驗前挑選出大小基本一致的延胡索塊莖120塊，進行消毒處理后用于處理試驗。

試驗場地位于重慶市萬州區重慶三峽學院種植基地(108°45′06″E，30°75′72″N)。土壤取自重慶三峽學院種植基地，將土壤樣品中雜物剔除，過2 mm篩，備用。供試土壤基本性質如下：土壤類型為紅土，土壤pH 6.3，有機質含量18%，全氮含量0.22%，水解氮含量12.58 mg·kg-1，速效鉀含量50.34 mg·kg-1，速效磷含量11.3 mg·kg-1，Cr6+含量67.32 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

本試驗依據《GB15618-2018土壤環境質量 農用地土壤污染風險管控標準(試行)》[7]，采用土培試驗，采用K2Cr2O7作為不同濃度外源Cr6+的處理因子，以溶液形式加入種植土壤中，設計7個K2Cr2O7處理濃度(表1)，以土壤中不添加外源Cr6+處理作為對照組(CK)。每個種植盆裝入8 kg供試土壤，每盆均勻播種5塊延胡索塊莖。按照林日長等[8]提出的技術規范進行種植管理，定期查看生長情況，實驗設置3個平行。150 d后采集供試植物樣本，分別測定延胡索地上部分Cr6+含量、地下部分Cr6+含量、株高、生物量、膜質過氧化物丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量以及延胡索體內抗氧化系統指標SOD活性、POD活性、CAT活性、GSH含量和AsA含量。

表1 各處理中土壤Cr6+濃度Table 1 Cr6+ concentration of soil under different treatments (mg·kg-1)

1.3 測定項目及方法

用刻度尺測量株高；用分析天平測量延胡索生物量；鉻含量的測定采用微波消解-原子吸收分光光度法[9]進行；MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法進行[10]；采用NBT光還原法[11]進行SOD活性的測定；CAT活性采用紫外分光光度計進行測定[11]；采用愈創木酚法[11]對POD活性進行測定；GSH和AsA含量的測定方法參照Rai等[12]的方法。

1.4 數據分析與處理

用Microsoft Excel 2019處理數據、繪制圖表；采用SPSS 20進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 鉻處理下延胡索植株鉻累積情況

圖1為不同濃度Cr6+處理下，延胡索植株體內、地上和地下部分的鉻含量變化情況。隨著外源添加Cr6+濃度的增加，延胡索植株內、地上部分、地下部分Cr6+含量均升高；且在相同濃度Cr6+處理條件下，地上部分Cr6+含量高于地下部分Cr6+含量。同時，當對延胡素植株的處理濃度達到最高時(T6處理)，延胡索體內Cr6+含量較CK增加了2倍左右，達到2 750.3 mg·kg-1DW。當土壤中Cr6+濃度在T5～T6區間時，延胡索地上部分、地下部分Cr6+含量相對于CK增加百分比最大；在T6時，地上部分、地下部分分別達到218.72%和196.24%。這說明在Cr6+處理濃度為CK～T6范圍內，外源添加Cr6+濃度越高，富集含量也越高，相對于CK 的增加量也隨之增加，且表現出明顯的正相關關系。

圖1 不同處理下延胡索體內、地上部分、地下部分鉻含量Fig.1 Chromium content in the body, aboveground and underground of Corydalis yanhusuo under different treatments

2.2 鉻處理對延胡索株高和生物量的影響

圖2為不同濃度Cr6+處理下延胡索植株株高與生物量的變化情況。隨延胡索植株體內Cr6+含量的增加，延胡索植株株高、生物量總體呈現先增后減趨勢。當土壤中Cr6+濃度低于T2時，Cr6+濃度越高，植株株高、生物量越大，且在T2時，與CK相比顯著增加(P<0.05)；當土壤中Cr6+濃度增加至T4(131.32 mg·kg-1)時，延胡索植株的株高、生物量有所下降，但仍然高于CK；當土壤中Cr6+濃度進一步增加至T5時，延胡索生長受到抑制，其株高、生物量均低于CK，且較T2時減少近1/3，說明此時延胡索植株生長受到嚴重危害，生理、生化過程受到一定的阻礙，生長發育停滯。

2.3 鉻處理對延胡索MDA含量的影響

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化物最終分解產物，其含量的高低可反映細胞膜脂過氧化的程度和植物對逆境反映的強弱[2]。圖3顯示了外源添加不同濃度Cr6+對延胡索植株內MDA含量的影響。分析發現，當土壤中Cr6+濃度低于T1時，與CK相比，MDA含量增加并不明顯(P>0.05)；而當土壤中Cr6+濃度在T2時，MDA含量較CK顯著增加(P<0.05)，為CK的1.4倍；當處理濃度達到最大時(T6)，MDA含量達CK的6.9倍。表明土壤中Cr6+濃度越高，對植株產生的傷害越大。

2.4 鉻處理對延胡索抗氧化酶活性的影響

圖4顯示了不同Cr6+處理下，延胡索抗氧化酶活性的變化。SOD作為植物體內清除ROS的第一個關鍵酶，可以將超氧陰離子自由基歧化為H2O2[13]。由圖4可知，當土壤中Cr6+濃度在67.32～323.32 mg·kg-1范圍內，SOD活性相對CK增加百分比隨Cr6+濃度的增高而呈現下降趨勢，當濃度達到323.32 mg·kg-1時，SOD活性達到最小，與CK的SOD活性相比下降達94.18%。通過SOD歧化產生的H2O2可以通過CAT與POD的降解來清除[13]。延胡索植株細胞中CAT活性隨外源添加Cr6+濃度的增加而表現為先增后減的趨勢。當土壤中Cr6+濃度低于131.32 mg·kg-1時，延胡索植株中CAT活性均高于CK；在濃度為99.32 mg·kg-1時，CAT活性較CK增加百分比達到峰值為21.32%；在131.32～323.32 mg·kg-1濃度范圍內，CAT活性表現出減少趨勢；當外源Cr6+處理濃度達到最高，CAT活性最小，較CK減小了81.50%。現有研究顯示，嚴重的逆境也可以增強POD的活性，因為逆境的處理會使得植株產生更多的過氧化物[14]，植株在逆境下受到的損傷程度越嚴重，其POD活性則會隨之增高。本試驗中，POD活性隨土壤中Cr6+濃度增大而增加，當濃度為323.32 mg·kg-1時，POD活性較CK增加174.68%左右。

注：不同小寫字母表示處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note: Different small letters indicate significant difference at P<0.05 level.圖2 鉻處理對延胡索株高和生物量的影響Fig.2 Effect of chromium treatments on plant height and biomass of Corydalis yanhusuo

注：不同小寫字母表示處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note: Different small letters indicate significant difference at P<0.05 level.圖3 不同處理下延胡索MDA含量Fig.3 MDA content of Corydalis yanhusuo under different treatments

圖4 不同濃度鉻處理下延胡索SOD、POD、CAT活性增加百分比Fig.4 Percent increase of SOD, POD and CAT activities in Corydalis yanhusuo under different Cr6+ treatment

2.5 鉻處理對延胡索GSH-AsA循環抗氧化物質的影響

正常情況下，GSH和AsA可以直接與超氧陰離子自由基等活性氧反應，也可通過GSH-AsA循環清除SOD歧化產生的H2O2[15]。從圖5可以看出，在Cr6+處理下，隨處理濃度升高，GSH、AsA含量均呈下降趨勢，且AsA下降幅度高于GSH的下降幅度。當土壤中Cr6+濃度達到323.32 mg·kg-1時，GSH、AsA含量相對于CK分別下降61.28%和75.37%。

圖5 不同濃度鉻處理下延胡索GSH、AsA含量增加百分比Fig.5 Percent increase of GSH and AsA content in Corydalis yanhusuo under different Cr6+ treatment

3 討論

3.1 延胡索對鉻的吸收和轉運

在相關研究中發現，一般植物對重金屬的富集規律為地上部分重金屬含量<地下部分重金屬含量。Shanker等[16]研究表明，與地上部分相比，2個品種的大豆根系中都累積了大量的Cr，其種子中僅發現0.1%的Cr，而其根系之中存在的Cr高達98%。這與本研究中延胡索植株中重金屬鉻分布情況相反，這可能是由于延胡索根系吸收Cr6+后，Cr6+在其體內由地下部分向地上部分的遷移率較高，與此同時，Cr6+向上運輸量大，從而導致莖葉中Cr6+含量較地下部分相對要高[17]。延胡索對Cr6+的這種轉運機制使得其地下塊莖藥用部分的重金屬積累更少，能夠更好地被使用。

3.2 鉻含量與延胡索生長的關系

重金屬Cr是植物生長發育所必需的金屬元素之一，但其含量超過植物體生長所需時，則會產生毒害作用，從而對植物細胞的結構和功能產生傷害[18]。黑淑梅[19]在關于Cr6+對小麥生長影響的研究中發現，當土壤中Cr6+濃度較低時，對玉米苗生長有明顯的刺激作用；但濃度過高后，有明顯的抑制作用。本研究結果表明，土壤中Cr6+濃度低于83.32 mg·kg-1時，延胡素植株株高、生物量均保持良好的增長趨勢，這充分發揮了Cr作為必需元素的作用；隨著土壤中Cr6+濃度的升高，對延胡素株高、生物量的影響逐漸顯著，土壤Cr6+濃度為131.32 mg·kg-1的實驗組，使得延胡索植株的株高、生物量顯著減小，但仍高于CK；在此濃度之后則表現為延胡索株高、生物量均低于CK，證明在延胡索對Cr6+脅迫的耐受閾值為131.32 mg·kg-1。可能是因為土壤中高濃度的Cr6+脅迫對延胡索根系的細胞結構造成了破壞，使得延胡索體內Cr6+含量增加，從而導致機體的失衡。

3.3 鉻對延胡索MDA含量和抗氧化系統的影響

MDA是植物體內ROS累積水平和細胞膜系統受損程度的評判指標[20]。在外源鉻脅迫下MDA含量與處理濃度呈正相關，這說明Cr6+處理使得延胡索體內的ROS產生和清除平衡被打破，從而使得ROS大量積累，積累的ROS則引發了膜脂過氧化，因此MDA含量進一步增加，這與陳順鈺等[21]、高揚等[5]的研究結果一致。

Klaus等[2]與郭紅葉[9]的研究都表明，植物抗氧化系統活性變化的特征是指示植物對環境脅迫響應類型的指標之一。本研究中，SOD活性降低，說明歧化超氧陰離子自由基的能力減弱，此時應該有大量ROS在植物體內積累，將導致植株生長受到抑制甚至死亡。但從試驗中可知，在土壤中Cr6+濃度低于131.32 mg·kg-1時，Cr6+對延胡索的生長表現為促進作用。綜合分析，出現這種現象可能由于SOD初始活性較高，因此，當土壤中Cr6+濃度低于131.32 mg·kg-1時，SOD仍然保持有較高的活性將超氧陰離子自由基歧化分解為H2O2，而POD與CAT活性也升高用以分解H2O2，因此，雖然此時植物體內產生的ROS增加，但利用抗氧化酶系統的清除能力，延胡索體內的ROS能保持在正常范圍內，并且在此濃度下可能對延胡索體內生長基因的表達具有促進作用，所以延胡索植株在土壤中Cr6+濃度低于131.32 mg·kg-1時，株高、生物量均表現為增加趨勢。但當土壤中Cr6+濃度達到195.32 mg·kg-1后，雖然POD活性有較大幅度的增加，但是由于MDA含量顯著上升(P<0.05)，且SOD對于超氧陰離子自由基的分解能力明顯減弱，此時延胡索植株受到嚴重脅迫，因此其生長受到抑制。而GSH與AsA含量均表現出下降趨勢，分析其主要原因，AsA的不斷還原再生主要是GSH起作用，而GSH含量降低必然導致還原再生減弱，因此，AsA含量同樣隨之降低。本研究中用不同濃度Cr6+對延胡索植株進行處理的實驗結果均與此相符，延胡索植株細胞內GSH含量與AsA含量呈現正相關關系，即伴隨著GSH含量的減少AsA含量也隨之減少。同時，延胡索植株內的Cr6+可誘導PCs的合成，而PCs的前體則為GSH，因此，當延胡索受到Cr6+的處理后，GSH用于合成PCs也將會使得GSH含量的減少。此時，GSH-AsA循環就受到限制，這導致H2O2清除同時也受到限制，因此導致H2O2在細胞中累積。同樣，在土壤中Cr6+濃度低于131.32 mg·kg-1時，兩者含量雖然減少，但其還是保持一定的清除能力以清除H2O2。綜合以上抗氧化系統各指標的變化情況分析，在外源添加Cr6+濃度增加的情況下，包括SOD、GSH、AsA在內的大部分抗氧化酶活抗氧化劑，在外源添加Cr6+處理一開始時即表現為活性或含量降低，但在此種情況下，延胡索植株生長仍受到促進，分析認為，雖然受到了Cr6+的處理，但由于延胡索體內本身此類專性抗氧化酶與非專性抗氧化劑活性或含量較高，且一定濃度Cr6+的存在激發了延胡索體內其他酶類的表達，進而使得延胡索生長受到促進；但是一旦Cr6+濃度過高，抗氧化系統對植物的保護能力減弱，植物體內細胞結構以及生理生化反應遭受破壞，最終使得延胡索植株生長受到抑制[22]。