柚皮揮發油化學成分及對灰葡萄孢菌的抑菌活性

葉肖辰皓，姜珊珊，焉炳飛*，葉 敏*

1煙臺大學化學化工學院，煙臺 264005；2云南農業大學植物保護學院，昆明 650201

水果和蔬菜富含維生素、無機鹽和植物纖維，是人體所需維生素、礦物質和膳食纖維的重要來源，也是僅次于糧食的主要農產品[1]。新鮮果蔬在貯運過程中常常會因植物病原菌侵染而發生病變腐爛，造成巨大的經濟損失和資源浪費[2]。灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)是一種導致草莓、番茄等果蔬采后發生灰霉病的重要植物病原真菌[3]。長期以來，國內外防治果蔬采后灰霉病的主要方法是使用人工合成的化學殺菌劑，其中常用的化學殺菌劑有噻菌靈(triabendazole)、甲基硫菌靈(thiophanate-methyl)、異菌脲(iprodione)等[4]。然而，已有足夠的證據顯示，化學殺菌劑長期用于果蔬采后抑菌防腐不僅對人體健康造成較大危害，同時也增大了致病微生物產生抗性的潛在風險[5]。大量研究結果表明，某些植物的揮發油(essential oils)能夠有效控制果蔬的采后病害，從而降低因使用化學殺菌劑造成的食品安全風險[6]。

柚(Citrusmaxima)是蕓香科柑橘屬喬木的果實，屬于芳香類水果，主要分布于東南亞及我國的長江以南地區。我國是世界上名列第二的柚子種植大國，柚子的種植面積和產量僅次于美國[7]。柚皮占柚子重量的三分之一，食用或加工后產生的大量柚皮不僅污染環境，而且是一種資源浪費[8]。有報道稱柚皮提取物對多種植物病原菌有顯著的抑菌活性[9]，為了更好地開發和利用柚皮這一天然的抑菌物質資源，本研究以果蔬采后重要致病真菌灰葡萄孢菌作為供試靶標，對柚皮揮發油的抑菌活性進行研究，探討將柚皮揮發油用于果蔬采后抑菌防腐的可能性。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

氣相色譜儀(Agilent 7890B具FID檢測器，美國Agilent公司)；氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent 7890A/5975，美國Agilent公司)；HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國J&W Scientific 公司)；電子分析天平(AL-104型，瑞士Mettler Toledo儀器有限公司)；旋轉蒸發儀(Buchi R-114，瑞士Buchi公司)；低溫冷卻循環泵(DLS-5L/25，鞏義市予華儀器有限責任公司)；超聲波清洗器(SK8210LHC，上海科導超聲儀器有限公司)；智能光照培養箱(MGC-300A，上海一恒科技有限公司)；電熱套；水蒸汽蒸餾裝置；微量進樣器等。

1.2 試劑

正十三烷、正十六烷、正十八烷(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；檸檬烯(美國Sigma-Aldrich公司，含量95%)、月桂烯(美國Sigma-Aldrich公司，含量94%)；正己烷(分析純，天津化學試劑有限公司)；高純氦氣(純度99.999%，昆明梅賽爾氣體有限公司)；葡萄糖(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；瓊脂粉(分析純，北京索萊寶科技有限公司)。

1.4 實驗材料

實驗用柚子為福建平和產琯溪蜜柚，購自昆明市農貿市場，取新鮮柚子將皮剝下備用。本研究使用的灰葡萄孢菌菌種，為云南農業大學云南生物資源保護與利用國家重點實驗室保藏菌種。

2 實驗方法

2.1 柚皮揮發油提取及密度測定

采用水蒸氣同時蒸餾萃取法提取柚皮揮發油。現有研究結果表明[10,11]，采用水蒸氣蒸餾提取植物揮發油，植物材料與水的料液比大多采用1∶3或1∶4本研究采用1∶3。準確稱取新鮮柚皮200 g于提取瓶中，加入600 mL蒸餾水，搖勻。將200 mL正己烷裝入溶劑瓶中，分別加熱至沸騰，自水和溶劑回流正常開始計時，提取時間為6、8、10和12 h，提取完成后正己烷經無水NaSO4脫水過濾，濾液在40 ℃下減壓除去溶劑得到柚皮揮發油，每個實驗重復3次，依據3次重復的結果計算平均得率。

準確移取柚皮揮發油1.0 mL于干燥的稱量瓶中稱重(精確至0.001 g)，計算揮發油的密度(g/cm3)。

2.2 柚皮揮發油化學成分的GC-FID分析

色譜柱：HP-5MS 石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國J&W Scientific 公司)；柱箱溫度：初溫40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持6 min；進樣口溫度：230 ℃；檢測器溫度260 ℃；載氣為高純氦氣(純度99.999%)，流量1.0 mL/min；燃氣為氫氣(純度99.9%)，流量：60 mL/min；助燃氣為無水空氣，流量：400 mL/min；進樣分流比10∶1；進樣量1.0 μL，樣品濃度1.0 mg/mL(溶劑為正己烷)。

2.3 柚皮揮發油化學成分的GC-MS分析

2.3.1 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5MS 石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱箱溫度：初溫40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持6 min；進樣口溫度：230 ℃；載氣為高純氦氣(純度99.999%)，流量1.0 mL/min；分流比10∶1，進樣量1.0 μL，樣品濃度1.0 mg/mL(溶劑為正己烷)。

2.3.2 質譜條件

EI離子源，電離能量：70 eV，掃描范圍：50～550 amu，四極桿溫度：150 ℃，離子源溫度：230 ℃，接口溫度：280 ℃，EM電壓：1 450 V，溶劑延遲：6 min。

2.4 柚皮揮發油及其主要單體化合物抑菌活性測定

2.4.1 培養基的制備

本研究使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL)，高壓濕熱滅菌(121 ℃，30 min)后備用。

2.4.2 揮發油及其主要單體化合物接觸抑菌活性測定

本研究采用Gogolous等[12]的菌絲生長速率法，測定柚皮揮發油及其主要單體化合物的抑菌活性。將柚皮揮發油及其主要單體化合物用適量丙酮溶解，加入與丙酮等量的Tween-80 搖勻后用滅菌蒸餾水配制成系列預濃度的揮發油乳濁液，待PDA培養基冷卻至45 ℃時，將揮發油乳濁液加至培養基中(揮發油乳濁液體積與培養基體積比為 1∶9)，充分混勻后移入直徑為9 cm的培養皿制成含揮發油及其主要單體化合物62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL的PDA含藥平板，空白對照培養基加入與處理培養基等量的丙酮和Tween-80。

在經7天預培養的病原菌菌落邊沿用內徑5 mm打孔器制取菌餅后將菌絲面分別接種到含藥及對照(含等量溶劑和Tween-80)的PDA培養基平板中心，于25 ℃下黑暗培養1、2、3、4、5和6 天后用十字交叉法分別測量各處理的菌落直徑并計算其平均值，依據下列公式計算各處理對病原菌菌絲的生長抑制率，每處理重復3次。

2.4.3 揮發油及其主要單體化合物熏蒸抑菌活性測定

采用Chutia等[13]的培養皿對扣熏蒸法，測定柚皮揮發油及其主要單體化合物的抑菌活性。在經7天預培養的病原菌菌落邊沿用內徑5mm打孔器制取菌餅后將菌絲面接種到PDA培養基平板中心。在直徑40 mm的無菌濾紙片上用微量進樣器分別準確滴加濃度為62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL的柚皮揮發油及其主要單體化合物(濃度按培養皿對扣的凈空體積折算)并置于培養皿蓋中，將接種后的PDA培養基平板倒扣在培養皿蓋上用帕拉膜(Parafilm)密封后25 ℃下黑暗培養，接種后1、2、3、4、5和6天后用十字交叉法分別測量各處理的菌落直徑并計算其平均值，依據上列公式計算各處理的菌絲生長抑制率，每個處理重復3次。

2.5 數據分析

用SPSS17.0數據處理軟件對實驗數據，結合Student-Newman-Keuls檢驗進行單向ANOVA分析，評價處理間的差異顯著性和重復間的離散度。

3 結果與分析

3.1 柚皮揮發油提取時間與得率

水蒸氣蒸餾不同時間提取柚皮揮發油得率和物理性狀結果，如表1所示。

試驗結果表明，用水蒸氣同時蒸餾萃取法提取柚皮揮發油的最佳提取時間為10 h，得率為0.32%(w/w)，柚皮揮發油密度為0.66 g/cm3。

表1 不同時間提取柚皮揮發油得率

注：得率為均值±標準差。

Note:Values are mean ± standard deviation (n=3).

3.2 柚皮揮發油化學成分分析

3.2.1 柚皮揮發油化學成分的GC-MS和GC-FID分析

GC-MS 分析結果表明，柚皮揮發油中共有8個主要化學成分，占揮發油總量的99.8%，柚皮揮發油化學成分的總離子流圖，詳見圖1。

圖1 柚皮揮發油GC-MS分析的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of essential oil from C.maxima peel

通過NIST08質譜譜庫檢索并結合GC-FID保留指數測定鑒定了柚皮揮發油中8個主要成分的化學結構，柚皮揮發油中所含的8個主要成分的質譜圖，如圖2所示；主要碎片離子數據，如表2所示。在GC-MS分析同等的色譜分離條件下，以正十三烷(n-octane)、正十六烷(n-hexadecane)和正十八烷(n-octadecane)為基準物質進行柚皮揮發油的GC-FID分析，按8種主要化學成分的保留時間，計算其保留指數。經與相關文獻[14-16]中揮發性化學成分的GC-FID保留指數比對，柚皮揮發油中8中化學成分的保留指數分別與相同或相近氣相色譜分析條件下3-methyl-apopinene、α-蒎烯(α-pinene)、月桂烯(myrcene)、檸檬烯(limonene)、α-methyl-α-[4-methyl-3-pentenyl]oxiranemethanol、氧化芳樟醇(linalool oxide)、藍桉醇(globulol)和香柏酮(nootkatone)的保留指數相吻合。揮發油中各個組分的相對含量依據GC-FID的分析結果，采用歸一化法按峰面積大小進行定量。柚皮揮發油GC-MS分析和GC-FID保留指數測定的結果，如表3所示。

圖2 柚皮揮發油主要成分的質譜圖Fig.2 Mass spectra of main chemical compositions in essential oil from C.maxima peel.

表2 柚皮揮發油主要成分的主要碎片離子數據

續表2(Continued Tab.2)

峰號Peak No.化合物Compound主要碎片離子Main fragment ion[m/z (%)]5α-Methyl-α-[4-methyl-3-pentenyl]oxiranemethanol59 (99.9);94 (60.3);43 (52.7);111 (39.8);93 (38.5);55 (36.2);68 (31.8); 67 (25.8);41 (25.6);81 (19.6)6Linalool oxide59 (99.9);43 (66.4);55 (30.2);94 (28.3);68 (26.9);41 (26.2);111 (22.6); 93 (21.5);67 (19.2);81 (16.3)7Globulol43 (99.9);41 (62.3);69 (45.2);81 (43.5);109 (41.2);55 (35.4);95 (34.2);67 (33.3);107 (30.6);93 (30.0)8Nootkatone147 (99.9);121 (77.4);146 (73.5);161 (69.9);41 (68.4);133 (64.5);200 (64.2);203 (59.7);175 (56.7);79 (54.8)

表3 柚皮揮發油的主要化學成分

表4 接種后不同時間柚皮揮發油對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性

注：菌絲生長抑制率數值之后為±標準差(三次重復)；同列平均值后的字母不同表示經S-N-K檢驗在P= 0.05水平上差異顯著。

Note:Values are mean ± standard deviation (n=3);Means in the same column followed by the different letter were significant different according to S-N-K test atP= 0.05.

3.3 柚皮揮發油的抑菌活性

3.3.1 柚皮揮發油的接觸抑菌活性

接種后不同時間柚皮揮發油對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性實驗結果，如表4所示。

試驗結果表明，柚皮揮發油對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性與處理劑量成正相關，接種第2天后與時間成負相關，結果見表4。總體來看柚皮揮發油對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性較低，活性最高值為接種后第2天的2 000 μg/mL處理，對菌絲生長的抑制率為80.74%，其余處理的活性均低于60%。接種第4天后250 μg/mL及以下處理的抑菌活性與空白對照相比在P<0.05水平上無顯著差異。

3.3.2 柚皮揮發油的熏蒸抑菌活性

接種后不同時間柚皮揮發油對灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性實驗結果，如表5所示。

表5 接種后不同時間柚皮揮發油對灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性

注：菌絲生長抑制率數值之后為±標準差(三次重復)；同列平均值后的字母不同表示經S-N-K檢驗在P=0.05水平上差異顯著。下同。

Note:Values are mean ± standard deviation (n=3);Means in the same column followed by the different letter were significant different according to S-N-K test atP= 0.05.The same as below.

試驗結果表明，柚皮揮發油對灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性與處理劑量成正相關，接種第2天后與時間成負相關，結果見表5。總體來看當柚皮揮發油濃度在低于500 μg/mL時抑菌活性不突出，對菌絲生長的抑制率大部分均低于50%，但1 000 μg/mL及以上濃度處理則表現出較好的抑菌活性，2 000 μg/mL處理在接種后不同時間對菌絲生長的抑制率均為100.00%，與其它各處理在P<0.05水平上均差異顯著。

3.4 柚皮揮發油中主要單體化合物抑菌活性

柚皮揮發油中兩種相對含量較高的化學成分是檸檬烯(73.68%)和月桂烯(14.64%)，為明確這兩種主要成分的抑菌活性，進行了檸檬烯和月桂烯對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性和熏蒸活性的測定。

3.4.1 檸檬烯的接觸抑菌活性

接種后不同時間檸檬烯對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性實驗結果，如表6所示。

表6 接種后不同時間檸檬烯對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性

試驗結果表明，檸檬烯對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性與處理劑量成正相關，接種第2天后與時間成負相關，結果見表6。總體來看檸檬烯對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性較低，活性最高的為接種后第2天的2 000 μg/mL處理，其對菌絲生長的抑制率也僅為54.11%，其余各處理的抑菌活性均低于50%。125 μg/mL及以下處理的抑菌活性與空白對照相比，在P<0.05水平上無顯著差異。

3.4.2 檸檬烯的熏蒸抑菌活性

接種后不同時間檸檬烯對灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性實驗結果，如表7所示。

試驗結果表明，檸檬烯對灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性與處理劑量成正相關，接種第2天后與時間成負相關，結果見表7。總體來看當檸檬烯濃度在低于500 μg/mL時抑菌活性較低，對菌絲生長的抑制率大多低于50%。1 000 μg/mL及以上濃度處理則表現出較好的抑菌活性，2 000 μg/mL處理在接種后不同時間的菌絲生長抑制率均為100.00%。各處理的抑菌活性與空白對照相比，在P<0.05水平上均差異顯著。

表7 接種后不同時間檸檬烯對灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性

檸檬烯接觸和熏蒸兩種不同處理方法對病原菌菌絲生長的抑制活性熏蒸處理的要高于接觸處理的抑制活性。

3.4.3 月桂烯的接觸抑菌活性

月桂烯對灰葡萄孢菌接種后不同時間的接觸抑菌活性實驗結果，如表8所示。

表8 接種后不同時間月桂烯對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性

試驗結果表明，月桂烯對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性與處理劑量成正相關，接種第2天后與時間成負相關。總體來看，月桂烯對灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性比較低，2 000 μg/mL處理2天時的菌絲生長抑制率也僅為51.02%，其余處理的抑菌率均低于此值。大部分處理的抑菌效果與空白對照相比，在P<0.05水平上均無顯著差異。

3.4.4 月桂烯的熏蒸抑菌活性

月桂烯對灰葡萄孢菌接種后不同時間的熏蒸抑菌活性實驗結果，如表9所示。

表9 接種后不同時間月桂烯對灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性

續表9(Continued Tab.9)

濃度Concentration(μg/mL)菌絲生長抑制率Mycelial growth inhibition (%)1天2天3天4天5天6天50082.43±5.09d53.02±2.93e36.01±1.66d27.32±3.46e19.50±3.19d13.58±3.10c1 000100.00±0.00e64.45±2.30f50.38±2.51e38.23±0.99f26.98±2.00e20.75±0.45d2 000100.00±0.00e100.00±0.00g88.84±1.47f80.00±1.23g70.11±1.35f60.79±0.69eCK0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a

試驗結果表明，月桂烯對灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性與處理劑量成正相關，接種第2天后與時間成負相關。總體來看月桂烯濃度在1 000 μg/mL及以下時抑菌活性較低，對菌絲生長的抑制率大多低于50%，62.5與125 μg/mL兩個處理間在P<0.05水平上無顯著差異，但濃度為2 000 μg/mL的處理則表現出較好的抑菌活性。

4 結論

現有研究結果表明，植物揮發油是一個由多種揮發性化學成分組成的復合體系，其中萜類、酚類、醇類、醛類和芳香化合物是植物揮發油的重要成分。很多單萜(monoterpene)和倍半萜(sesquiterpene)類化合物在植物與病原菌的互作中，具有較強的生物活性和重要的生態功能，其中有的化合物在抑制果蔬采后致病微生物方面具有重要的研究價值。

植物病原菌的侵染和危害，是加速采收后果蔬腐爛最重要的致腐因子，利用植物揮發油進行果蔬采后抑菌防腐，國內外學者做過很多研究[17-19]。Nengguo等[20]認為蕓香科有些植物的揮發油能抑制某些果蔬的采后病害。Nengguo等的研究結果表明，柑橘揮發油對水果的重要致病真菌意大利青霉菌(Penicilliumitalicum)和指狀青霉菌(P.digitatum)具有顯著的抑菌活性。本研究結果表明，柚皮揮發油對果蔬采后重要致病真菌灰葡萄孢菌的菌絲生長具有明顯的抑菌活性。柚子與柑橘同為蕓香科植物，本研究結果印證了Nengguo Tao等的觀點。

圖3 柚皮揮發油及其主要化學成分對灰葡萄孢菌處理后6天的熏蒸抑菌效果示意圖Fig.3 Antifungal activity of essential oil and its chemical compositions vapour against B.cinerea after 6 days exposure注：A-柚皮揮發油；B-檸檬烯；C-月桂烯。Note:A-Essential oil from C.maxima peel;B-Limonene;C-Myrcene.

本研究結果表明，柚皮揮發油中共有8個主要化學成分，其中含量最高的是檸檬烯天開始，柚皮揮發油和檸檬烯的抑菌效果顯著強于月桂烯。柚皮揮發油和檸檬烯1 000 μg/mL處理表現出較好的抑菌活性，2 000 μg/mL處理在接種后不同時間的菌絲生長抑制率均為100.00%，抑菌活性極顯著優于同等劑量的月桂烯。因此，可以推測檸檬烯是柚皮揮發油中的主要抑菌活性成分。柚皮揮發油、檸檬烯和月桂烯1 000 μg/mL接種后6天對灰葡萄孢菌的抑菌活性結果，如圖3所示。

用同一種有抑菌活性的揮發性化學成分熏蒸和接觸處理靶標病原菌，不同處理方式間的抑菌活性可能會有較大差異[10]，本研究的結果也證明了這種現象。柚皮揮發油在同等劑量下接觸和熏蒸處理灰葡萄孢菌，其抑菌活性表現出很大差異，熏蒸處理的抑菌活性顯著高于接觸處理，且各處理的抑菌活性與處理時間成反比(圖4)。關于同等用藥劑量下為什么熏蒸處理的抑菌活性遠高于接觸處理，筆者認為熏蒸處理揮發性抑菌活性成分通過空氣與菌體全方位接觸，使藥效得到充分發揮，而接觸處理菌體僅有接觸培養基的部分才能受藥，藥效不能得到充分發揮。由于兩種給藥處理方法病原菌受藥的面積相差較大，從而導致抑菌活性出現較大差異。

圖4 柚皮揮發油不同處理方法對灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌效果(1 000 μg/mL)Fig.4 Antifungal activity of essential oil with different treatment methods against B.cinereaafter 6 days exposure (1 000 μg/mL)

綜上所述，柚皮揮發油對灰葡萄孢菌具有顯著的抑菌活性，其主要化學成分是檸檬烯和月桂烯等8種揮發性有機化合物，其中含量最高的是檸檬烯(73.68%)和月桂烯(14.64%)。根據本研究的結果推測，檸檬烯是柚皮揮發油的主要抑菌活性成分。柚皮揮發油和檸檬烯單體化合物對灰葡萄孢菌熏蒸處理的抑菌活性顯著高于接觸處理，且各處理的抑菌活性與處理時間成反比。

致病真菌侵染是導致果蔬采后腐爛的重要因素，探尋可替代化學合成殺菌劑用于果蔬采后抑菌防腐的天然產物，對保障食品安全和公眾健康，具有極其重要的意義。我國柚子種植分布廣泛種植面積較大，因此柚皮資源豐富。本研究證明在離體條件下，柚皮揮發油對灰葡萄孢菌具有顯著的抑菌活性，下一步可在此基礎上通過深入研究，探討柚皮揮發油用于番茄灰霉病等由灰葡萄孢菌所致果蔬采后重要病害防控的可能性。