化學模式識別分析白及不同采收期次生代謝產(chǎn)物動態(tài)變化特征

秦亞東，汪榮斌，方鳳滿，李林華

1安徽中醫(yī)藥高等專科學校藥學系；2安徽師范大學生命科學學院，蕪湖 241002

白及為蘭科植物白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.的干燥塊莖，具收斂止血、消腫生肌之功[1]，作為臨床常用藥材，具悠久的藥用歷史。白及主要含有聯(lián)芐類、菲類、菲醌類、聯(lián)苯并菲類、黃酮類及2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類等化學物質(zhì)[2,6,7]，現(xiàn)代研究表明這些次生代謝產(chǎn)物在抗菌[3,4]、抗腫瘤[5,6]、抗炎[7]等方面不斷顯示新的活性。

近年來由于市場對白及的需求量增加，野生白及資源遭到了掠奪性采挖，面臨滅絕的危險，市場供應主要依靠人工栽培品。眾所周知，藥用植物次生代謝產(chǎn)物的含量與產(chǎn)地、環(huán)境、采收時期及加工等因素關系密切，代謝產(chǎn)物的種類及含量可能會對臨床療效產(chǎn)生影響。已有文獻報道白及主要有效成分含量與海拔高度關系密切[8]、野生與栽培品中天麻素(gastrodin，GAS)和1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(militarine，MIL)含量存在較大差異[9]；同時學者對不同產(chǎn)地白及指紋圖譜及多指標含量進行測定的基礎上對白及質(zhì)量評價及栽培品質(zhì)量研究進行了有益嘗試[9-11]。但對白及不同采收期，差異次生代謝產(chǎn)物及其動態(tài)變化規(guī)律研究尚未見報道。本文利用HPLC建立白及栽培品不同采收期次生代謝產(chǎn)物指紋圖譜，結合化學模式識別不同采收期特征差異成分及其動態(tài)變化規(guī)律，同時采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(HPLC-HRMS)技術對特征差異次生代謝產(chǎn)物進行定性分析，闡明特征差異代謝產(chǎn)物隨季節(jié)變化規(guī)律，以期為指導白及采收期及內(nèi)在質(zhì)量評價提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent 1290型超高效液相色譜色譜儀(Agilent,USA)、Shimadzu LC-20AD型高效液色譜相色譜儀(Kyoto，Japan)、AB Sciex Triple TOF 5600型高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB SCIEX，America)、DV215CD型 Discovery電子天平(Ohaus，USA)、JK-250DB型超聲波清洗儀(合肥金尼克機械制造有限公司)、Minispin型臺式離心機(Eppendorf，Germany)。

1.2 材料

引種安徽省南陵縣何灣鎮(zhèn)野生白及，經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等專科學校汪榮斌副教授鑒定為蘭科植物白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.，栽培于安徽中醫(yī)藥高等專科學校藥苑，栽培3年后，自2014年11月起每間隔半個月采集地下塊莖，樣品編號信息見表1。按《中國藥典》方法[1]除去泥土及須根后，置沸水煮15 min，曬至半干，除去外皮，曬干，粉碎后過40目篩，裝密封袋置4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 白及樣品信息及兩個主要差異性成分的含量(mg/g)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

樣品編號Sample No.采集時間Collection date天麻素GAS1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯MIL季節(jié)SeasonS202015.8.282.1922.584S212015.9.151.8424.094S222015.9.292.5119.014S232015.10.142.2522.094S242015.11.23.2617.884

1.3 試藥和試劑

GAS(批號：110807-201605)對照品購自中國食品藥品檢定研究院、MIL(批號：lot16122231)對照品購自上海遠慕生物科技有限公司；乙腈、甲酸為色譜級(TEDIA，USA)、水為實驗室自制超純水、其余試劑為市售分析純。

2 方法和結果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取白及粉末約0.5 g，置于15 mL具塞離心管中，精密加入60%(V∶V)甲醇-水溶液10 mL,控制超聲溫度不超過20 ℃，超聲1 h后離心處理(3 000 rpm)5 min，上層溶液過0.22 μm微孔有機濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定GAS、MIL對照品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，加60%(V∶V)甲醇-水溶液定容至刻度。精密量取GAS、MIL對照品溶液適量混合，搖勻后為混合對照品溶液，分別過0.22 μm微孔有機濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18column(50×4.6 mm，1.8 μm)，保護柱：Agilent SB-C18column(5×2.1 mm，1.8 μm)；流動相為溶劑A：0.1%甲酸乙腈，溶劑B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫，0～10 min，溶劑A由5%→20%，10～18 min，溶劑A由20%→30%，18～23 min，溶劑A 30%，23～30 min,溶劑A由30%→33%，30～45 min,溶劑A由33%→60%；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長285 nm，進樣量5 μL，典型色譜圖如圖1所示。

圖1 混合對照品(A)及白及典型樣品(B)HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of two mixed standards(A) and representative HPLC chromatograms of sample(B)注：1.天麻素；2.1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯。Note:1.GAS,2.MIL.

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗

取S5樣品，按上述條件制備供試品溶液,重復進樣6次,記錄各共有峰峰面積及保留時間，以MIL

色譜峰為參照，各共有峰相對峰面積及相對保留時間的RSD值均小于0.21%和0.72%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取S5樣品，按上述條件制備供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄各共有有峰峰面積和保留時間，以MIL色譜峰為參照，各共有峰相對峰面積及相對保留時間RSD值分別小于0.25%和1.24%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復性試驗

取S5號樣品6份,按上述條件制備供試品溶液，按上述條件獲取6份供試品指紋圖譜，記錄各共有峰峰面積和保留時間，以MIL色譜峰為參照，各共有峰相對峰面積及相對保留時間RSD值分別小于0.46%和1.57%，表明重復性符合指紋圖譜要求。

2.5 指紋圖譜的建立

白及樣品按上述方法處理并進行測定。數(shù)據(jù)以AIA.格式導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(中國藥典委員會，2004A版)，以S1號樣品為參照，時間窗寬度為0.1，采用中位數(shù)法，經(jīng)多點校正、自動匹配共生成共有峰16個。285 nm檢測波長下指紋圖譜疊加圖如圖2。

圖2 24批白及樣品的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of the 24 batches of Bletilla striata samples

2.6 定量分析

參照文獻[9-11]，利用外標一點法對GAS和MIL進行定量計算，結果見表1所示。由表1直觀分析可見，GAS在Class1(S1～S6，冬季)和Class2(S7～S12，春季)樣品中的含量高于Class3樣品(S13～S18，夏季)和Class4(S19～S24，秋季)，GAS在冬、春季節(jié)平均含量是夏、秋季節(jié)的1.76倍，全年最高含量是最低含量的3.69倍；而MIL則相反，其在Class3和Class4樣品中的含量高于Class1和Class2樣品，MIL在夏、秋季節(jié)的平均含量是冬、春季節(jié)的1.53倍，全年最高含量是最低含量的2.67倍。

2.7 液質(zhì)條件及特征峰定性分析

使用島津Shimadzu LC-20AD型HPLC進行色譜分離，色譜條件同“2.3”項；LC-Q-TOF-MS系統(tǒng)，采用電噴霧離子源(ESI)進行正(PI)、負離子(NI)模式全掃描，掃描范圍m/z50～1 500；噴霧電壓4.5 kV，離子源溫度500 ℃，去簇電壓100 V，氣簾氣壓(N2)：35 psi，霧化氣壓(N2)：55 psi，輔助氣壓(N2)：60 psi。

應用LC-Q-TOF-MS技術，按上述色譜分離條件及質(zhì)譜條件，對白及指紋圖譜中7個特征峰進行分析，結果見表2所示。利用Agilent Mass Hunter version B.0400軟件對總離子流圖中的準分子離子峰進行提取，色譜峰2、9利用化學對照品比對；其余化合物利用精確相對分子質(zhì)量、二級碎片信息和文獻報道比對[13]進行初步鑒定。結果顯示特征峰按化學結構分為葡糖糖苷類：色譜峰2(4-羥甲基苯基-葡萄糖苷，gastrodin)；芐酯類：色譜峰4(4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯，blestroside)、色譜峰9(1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯，militarine)、色譜峰11(1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯-2-(4-O-肉桂酰基)葡萄糖苷，gymnoside Ⅴ)；菲類：色譜峰12(3，5-二羥基-1-甲氧基-9，10二氫菲，coelonin)、色譜峰14(芐基氫菲3，benzylhydrophenanthrene 3)、色譜峰13(4-甲氧基菲-2，7-二醇，4-methoxyphenanthrene-2，7-diol)。

2.8 多元統(tǒng)計分析

為更加客觀、直接的闡明不同采集時間白及次生代謝產(chǎn)物的差異性，利用SIMCA-P軟件進行PCA、PLS-DA分析，其得分圖可以提供可視化的白及樣品分類情況，載荷圖能夠直觀的分析對白及樣品分類起主要作用的變量信息。將白及24個采集時間點的HPLC指紋圖譜共有峰峰面積導入SIMCA-P 11.5軟件，經(jīng)歸一化處理后進行PCA分析，結果見圖3。由圖3可知，不同采集時間白及樣品Class1、Class2與Class3和Class4區(qū)分良好，但Class3和Class4難以達到有效區(qū)分，表明不同采集時間白及次生代謝產(chǎn)物存在差異。其中Class1樣品(S1～S6，冬季)和Class2(S7～S12，春季)分布在得分圖左側，t[1]象限負值區(qū)域，說明冬、秋兩季白及樣品次生代謝產(chǎn)物與夏、秋兩季差異明顯；Class3樣品(S13～S18，夏季)和Class4(S19～S24，秋季)分布在得分圖右側，t[1]象限正值區(qū)域，但夏季和秋季白及樣品彼此交叉，未能達到有效區(qū)分，說明夏、秋兩季白及樣品內(nèi)次生代謝產(chǎn)物差異不明顯。

表2 特征色譜峰初步定性結果

圖3 同采集時間白及樣品PCA得分圖Fig.3 Scores plot of PCA of Bletilla striata samples

為明確不同采集時間白及樣品次生代謝產(chǎn)物的差異性化學成分，縮小組內(nèi)差異，進一步采用有監(jiān)督模式的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，建立不同采集時間白及分類模型。由PLS-DA得分圖，由圖4A可知，Class1樣品(S1～S6，冬季)分布在最右側，t[1]象限正值和t[2]象限負值所組成的區(qū)域內(nèi)；Class2(S7～S12，春季)分布在得分圖右側，t[1]象限正值與t[2]象限正值所組成的區(qū)域內(nèi)，Class1和Class2以及與其他樣品區(qū)分效果較好，說明Class1和Class2之間以及與其他分類樣品中次生代謝產(chǎn)物差異明顯；Class3和Class4分布在得分圖左側，t[1]象限負值區(qū)域，同樣彼此交叉，未能實現(xiàn)有效區(qū)分，說明Class3和Class4次生代謝產(chǎn)物差異不明顯。

圖4 不同采集時間白及樣品PLS-DA得分圖(A)和載荷圖(B)Fig.4 Scores plot of PLS-DA and Loading plot of PLS-DA of Bletilla striata samples

由載荷圖4B可知，在t[1]方向，變量色譜峰2(gastrodin)、11(gymnoside Ⅴ)對樣品向t[1]正值方向分布起到積極作用，說明色譜峰2、11由t[1]正值向負值方向其峰面積有不斷變小的趨勢；而變量色譜峰12(coelonin)、13(4-甲氧基菲-2，7-二醇)、14(芐基氫菲3)對樣品向t[1]負值方向分布起到積極作用，其峰面積由t[1]正值向負值方向其峰面積有不斷變大的趨勢，與GAS含量分析結果一致。在t[2]方向，變量4(blestroside)、9(militarine)對樣品向t[2]正值方向分布起到積極作用，是引起樣品在t[2]方向分散的主要變量。有圖4B可見，Class3和Class4分布相互交叉，區(qū)分效果不明顯，表明上述變量在Class3和Class4兩類中差異不明顯，這與《中國藥典》記載白及夏、秋季節(jié)采集的要求[1]相一致。綜上，白及樣品在由冬季-春季-夏、秋季生長過程中菲類化合物(4-甲氧基菲-2，7-二醇、benzylhydrophenanthrene 3、coelonin)的含量有不斷增加的趨勢；糖苷類化合物(gastrodin)及芐酯類化合物(gymnoside Ⅴ)的含量則不斷變小的趨勢，在冬、春季含量高；芐酯類化合物(blestroside、militarine)的含量有不斷升高的趨勢，在夏、秋季含量最高。

所建立PLS-DA模型的R2X=0.936，R2Y=0.851，Q2=0.828，表明模型穩(wěn)定，預測能力強。上述變量色譜峰2(gastrodin)、11(gymnoside Ⅴ)、12(coelonin)、13(4-甲氧基菲-2，7-二醇)、14(benzylhydrophenanthrene 3)、4(blestroside)、9(militarine)的Variable Important Plot(VIP)值均大于1，根據(jù)變量VIP值大于1作為特征變量的原則，上述7個變量可作為白及在不同采集時期重要特征變量以及不同采集時期的主要差異化學成分，這些差異性化學成分為不同采集時期白及內(nèi)在質(zhì)量差異的物質(zhì)基礎。

3 討論

眾所周知，藥用植物次生代謝產(chǎn)物是藥效發(fā)揮的主要物質(zhì)載體，積極探索并闡明藥材在不同采收時間次生代謝產(chǎn)物累積差異及藥材質(zhì)量的形成規(guī)律具有重要意義。因此，針對白及栽培品不同采收時期樣品建立HPLC指紋圖譜，按采收季節(jié)對樣品進行分類，結合化學計量學分析方法，發(fā)現(xiàn)不同采收期樣品在PCA、PLS-DA分類中Class1樣品、Class2樣品與夏、秋兩季樣品能有效區(qū)分；而Class3和Class4樣品彼此交叉嚴重，難以獲得有效區(qū)分，說明7個特征變量成分在夏、秋兩季差異不如與春、冬兩季明顯。需要說明的是利用二極管陣列檢測器同時檢測254、270、285 nm指紋圖譜，254、270 nm下無監(jiān)督PCA分類模式難以將不同季節(jié)樣品進行有效區(qū)分，故本文采用285 nm建立指紋圖譜。7個特征變量中色譜峰2、11、12、13和14對樣品在不同季節(jié)分布影響顯著；變量色譜峰4和9主要是引起樣品在t[2]方向分散的主要特征變量。有文獻報道在大鼠血清中檢測到MIL、GAS和blestroside原型產(chǎn)物[14,15]，說明這些入血成分與不同臨床藥效可能存在一定的相關性。

本研究采用HPLC技術建立化學指紋圖譜，結合化學計量學方法得到7個特征變量，并利用LC-HRMS聯(lián)用技術初步鑒定了7個特征變量，闡明了不同采收時期白及差異性化學物質(zhì)基礎，并初步理清了7個特征化學成分在不同季節(jié)含量的變化趨勢，其結果與《中國藥典》中描述的夏、秋季采集相一致，在一定程度上驗證了夏、秋季采集的合理性；隨著白及次生代謝產(chǎn)物不斷被發(fā)現(xiàn)以及這些單體化合物在抗腫瘤、抗炎、抗菌等方面的作用不斷被闡明，根據(jù)7個特征化學成分動態(tài)變化規(guī)律以及臨床治療目的，提高這些藥效成分在白及藥材中的含量，保證臨床用藥效果，為更加科學的控制采收時期和合理的制訂白及藥材質(zhì)量標準提供理論依據(jù)和參考。