原發(fā)性開(kāi)角型青光眼致病基因的篩查

周 瑾 陳 謹(jǐn) 姚 磊 季 丹 蔣正軒 劉 君 葉龍玲 黃菊芳 張 毅

原發(fā)性開(kāi)角型青光眼（POAG）是一類解剖結(jié)構(gòu)正常，沒(méi)有任何繼發(fā)性青光眼誘因的遺傳性致盲眼病，是遺傳性青光眼最常見(jiàn)的類型，約占所有青光眼病例的75%～90%[1]，其發(fā)病機(jī)制不詳，但諸多研究表明其遺傳特性，基因變異是造成POAG的主要原因之一。與POAG發(fā)病有關(guān)的基因，主要包 括OPA1、MYOC、CYP1B1、OPTN、WDR36[2～3]，但這些已報(bào)道的基因可能未覆蓋這些基因的大片段基因缺失或重復(fù)突變，以及內(nèi)含子深部或基因調(diào)控區(qū)等區(qū)域，或者存在其他與POAG相關(guān)的基因未被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致不是所有POAG的患者都能檢測(cè)到相應(yīng)的致病基因。因此，擴(kuò)大收集有典型臨床意義的POAG患者，進(jìn)行相關(guān)眼科基因的深入研究具有深遠(yuǎn)意義。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集 收集2018 年-2019 年合肥名人眼科醫(yī)院和安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院17 例POAG患者標(biāo)本，進(jìn)行遺傳眼病的基因測(cè)序分析。在經(jīng)患者知情同意后，選擇17 例POAG患者的外周血DNA，對(duì)青光眼遺傳性因素相關(guān)的404 個(gè)基因進(jìn)行測(cè)序，分析測(cè)序數(shù)據(jù)及篩選變異后獲得候選變異。

1.2 POAG患者臨床診斷分析 收集的17例POAG患者中，男性10 例，女性7 例，年齡18～60 歲。均符合原發(fā)性開(kāi)角型青光眼診斷標(biāo)準(zhǔn)：眼壓檢查，24 h內(nèi)眼壓＞21 mmHg（1 mmHg =0.133 kPa）；檢查前房角，在眼壓升高時(shí)，雙前房角仍開(kāi)放；青光眼性典型視野缺損；青光眼性視神經(jīng)盤(pán)的典型改變；無(wú)引起相似視野和視盤(pán)改變的其他病因。12 例POAG患者通過(guò)藥物進(jìn)行保守治療，控制升高的眼壓。5 例行抗青光眼手術(shù)，其中1 例因左眼背光眼術(shù)后眼壓失控，右眼開(kāi)角型青光眼術(shù)后，行第二次青光眼手術(shù)。

1.3 基因檢測(cè)的方法 應(yīng)用過(guò)柱法從外周血提取DNA，通過(guò)測(cè)序技術(shù)，對(duì)基因外顯子區(qū)進(jìn)行直接測(cè)序，與參考序列進(jìn)行比較，從而發(fā)現(xiàn)可能存在的基因突變。本測(cè)序方法覆蓋了外顯子編碼區(qū)及內(nèi)含子-外顯子交界處的基因突變，但未能覆蓋這些檢測(cè)基因的大片段基因缺失或重復(fù)突變，以及檢測(cè)基因內(nèi)含子深部、基因調(diào)控區(qū)等區(qū)域。

2 基因檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)涉及眼病相關(guān)的404 個(gè)基因，具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 患者眼部相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果分析

2.1 BCOR基因，Xp11 NM_ 017745.5 Exon15 c.5003C＞G p.(Ser1668Cys) 該變異為錯(cuò)義突變，即染色體位置Xp11，參考序列NM_017745.5，第15 外顯子，cDNA水平的第5003 位堿基C變成了堿基G，預(yù)計(jì)會(huì)使蛋白水平的第1668 位的氨基酸Ser變成了氨基酸Cys，發(fā)生了Ser1668Cys雜合突變；HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，ESP6500siv2_ALL、千人基因組（1000 g 2015aug_ALL）和dbSNP147 數(shù)據(jù)庫(kù)均未見(jiàn)收錄。BCOR基因如發(fā)生病理性變異可引起小眼畸形綜合征，通常呈X連鎖顯性遺傳。以眼睛和身體其它部分發(fā)育異常為主要特征的先天性畸形，表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)眼異常，通常是出生時(shí)異常小或無(wú)眼球，導(dǎo)致視力受損或失明。其他眼部問(wèn)題包括白內(nèi)障，眼球震顫，眼缺損，并且患者患青光眼風(fēng)險(xiǎn)較高。

2.2 HSF4 基因，16q22 NM_001538.3 Exon15 c.1354_1364del p.（Ser452fs） 該變異為移碼突變，染色體位置16q22，參考序列NM_001538.3，第15外顯子，cDNA水平的第1354 位到1364 位的堿基缺失，預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)自第452 位氨基酸Ser開(kāi)始發(fā)生移碼；該變異靠近所編碼蛋白質(zhì)的末端，預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)編碼發(fā)生紊亂。HSF4 基因如發(fā)生致病變異可引起白內(nèi)障5型，以常染色體顯性的方式遺傳。HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道；ESP6500siv2_ALL、千人基因組（1000 g 2015aug_ALL）和dbSNP147 數(shù)據(jù)庫(kù)均未見(jiàn)收錄。檢測(cè)到受檢者攜帶HSF4 基因一個(gè)臨床意義未明的雜合變異，需結(jié)合臨床情況綜合判斷。

2.3 EYA1基因，8q13.3 NM_000503.5 Exon9 c.671G＞T p.（Gly224Val） 該變異為錯(cuò)義突變，預(yù)計(jì)會(huì)使所編碼蛋白質(zhì)第224 位氨基酸由Gly變?yōu)閂al。如發(fā)生致病突變可引起B(yǎng)ranchiootorenal綜合征1型（BOR1）、Branchiootic綜合征1 型（BOS1），均以常染色體顯性的方式遺傳，雜合突變的患者有50%的概率將致病突變傳遞給子代。BOR1 型患者臨床主要表現(xiàn)有感覺(jué)神經(jīng)性耳聾、傳導(dǎo)性耳聾、混合性耳聾、耳結(jié)構(gòu)發(fā)育異常、腮瘺管及囊腫、高腭弓、唇腭裂，腎發(fā)育異常等，且癥狀存在不完全外顯情況。BOS1 型與BOR1 型臨床癥狀相似，但一般沒(méi)有腎畸形。有文獻(xiàn)報(bào)道EYA1 基因可能與開(kāi)角型青光眼相關(guān)[4]，POAG患者及其女兒有EYA1 基因c.35G＞A（p.R12H）的雜合突變，但11歲女兒的表現(xiàn)型有青光眼風(fēng)險(xiǎn)的跡象，但不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，有待進(jìn)一步觀察。

2.4 OPA1基 因，3q29 NM_015560.2 Exon2 c.320C＞T p.（Ser107Leu） 該變異為錯(cuò)義突變。HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道；千人基因組（1000 g 2015aug_ALL）數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)收錄，ESP6500siv2_ALL和dbSNP147數(shù)據(jù)庫(kù)有收錄（rs781398129）；生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)其有致病可能性。如發(fā)生致病變異可引起B(yǎng)ehr綜合征，以常染色體隱性的方式遺傳。OPA1 基因如發(fā)生致病變異還可引起視神經(jīng)萎縮1 型，以常染色體顯性的方式遺傳。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道該基因的變異可能與正常眼壓性青光眼易感性相關(guān)[5]。

2.5 RPGRIP1基因，14q11 NM_020366.3 Exon6 c.844C＞T.p.（Leu282Phe） 該變異為錯(cuò)義突變。HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，ESP6500siv2_ALL和千人基因組(1000 g2015aug_ALL)數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)收錄，dbSNP147 數(shù)據(jù)庫(kù)有收錄。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道[6]該基因的變異提示RPGRIP1 基因可能是多種青光眼的易感基因。RPGRIP1 基因通過(guò)選擇性剪接在眼組織中表達(dá)多種亞型，這些亞型在視網(wǎng)膜神經(jīng)元和視網(wǎng)膜外具有不同的細(xì)胞和亞細(xì)胞位置、生化特性和物種特異性表達(dá)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)POAG的RPGRIP1 錯(cuò)義變異，可能會(huì)改變已知的POAG患者RPGRIP1 結(jié)構(gòu)和功能域的序列，并影響氨基酸的表達(dá)，在這份研究中健康的受試者中不存在RPGRIP1 的錯(cuò)義突變，同時(shí)在RPGRIP1 錯(cuò)義突變的2 例患者中，存在MYOC和CYP1B1 基因的錯(cuò)義。RPGRIP1 作為POAG的一個(gè)潛在的候選基因。因此，我們將RPGRIP1 突變的篩選擴(kuò)展。

2.6 CYP1B1基因，2q22 NM_000104.3 Exon2 c.319C＞G p.（Leu107Val） 該變異為錯(cuò)義突變。大量的文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞色素P450-1B基因與青光眼的發(fā)病有關(guān)。CYP1B1 是先天性青光眼最常見(jiàn)的致病基因，但也有報(bào)道稱其與POAG的發(fā)病有關(guān)。CYP1B1 基因缺陷型小鼠表現(xiàn)出房水排出結(jié)構(gòu)異常，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性凋亡和視乳頭增大和視神經(jīng)纖維束腫脹斷裂。

3 討 論

隨著POAG病例樣本量的增多，統(tǒng)計(jì)能力的提高，會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的位點(diǎn)。通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)（GWAS）研究，發(fā)現(xiàn)了共29個(gè)POAG的新位點(diǎn)(ABCA1、AFAP1、GMDS、0PMM2、TGFBR3、FNDC3B、ARHGEF12、GAS7等）[7]；同時(shí)應(yīng)用基因隊(duì)列測(cè)試這些基因的變異是否與POAG有關(guān)聯(lián)或者篩查出的這些變異是否與POAG的發(fā)病過(guò)程有關(guān)，但就目前已知的POAG患者的信息，以及沒(méi)有進(jìn)一步的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持，無(wú)法確定POAG與這些基因相關(guān)聯(lián)。針對(duì)POAG的一系列基因改變，需要密切關(guān)注臨床和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)展，同時(shí)拓展檢測(cè)基因的種類，以期為臨床實(shí)現(xiàn)POAG的基因診斷和基因治療提供理論上的支持。

篩查POAG可能的致病基因，有助于我們發(fā)現(xiàn)以前未知的生物學(xué)途徑，這些途徑在青光眼的發(fā)病原因和發(fā)病進(jìn)展中非常重要。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，這些發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)對(duì)這些途徑的進(jìn)一步研究，并有可能產(chǎn)生新的治療方法；短期來(lái)看，遺傳標(biāo)記可能具有預(yù)測(cè)價(jià)值，并有助于青光眼的個(gè)性化治療。而基因的改變是否會(huì)引起患者的臨床疾病，尚有待科學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展、數(shù)據(jù)的積累及更深入的基因功能學(xué)的研究。針對(duì)此類基因改變，臨床及實(shí)驗(yàn)室需要密切關(guān)注臨床進(jìn)展，在適當(dāng)時(shí)候?qū)Y(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充說(shuō)明，同時(shí)拓展檢測(cè)的基因種類。進(jìn)一步的研究需要充分確定青光眼的遺傳結(jié)構(gòu)，這是實(shí)現(xiàn)全面的遺傳檢測(cè)和靶向基因治療的必要步驟。