運(yùn)用MLPA對自然流產(chǎn)絨毛組織的遺傳學(xué)分析

鄧桂林 馬慶慶 喬印玲 盧 韋 蘇遠(yuǎn)華

隨著我國二胎政策的全面開放，妊娠婦女大幅度增加，高齡孕婦增多，流產(chǎn)患者也在不斷增加。研究顯示，我國流產(chǎn)患者中50%以上的流產(chǎn)原因?yàn)槿旧w異常，在染色體異常流產(chǎn)患者中染色體非整倍數(shù)異常又占絕大多數(shù)[1～2]，因此研究絨毛組織的染色體異常與自然流產(chǎn)的關(guān)系具有重要的作用。本醫(yī)院為了探究MLPA技術(shù)在查明流產(chǎn)原因方面的臨床價(jià)值，運(yùn)用MLPA對自然流產(chǎn)絨毛組織進(jìn)行染色體非倍體的診斷，以便指導(dǎo)下次妊娠，減輕患者心理負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本醫(yī)院于2017 年6 月-2019年2 月收治的66 例自然流產(chǎn)患者作為研究對象，將其流產(chǎn)絨毛組織作為觀察組，同時(shí)選擇66 例來我院體檢為正常生育的健康孕婦的絨毛組織作為對照組，且經(jīng)過染色體檢測為正常核型，所有患者年齡20～45 歲，平均年齡（32.47±2.14）歲，孕齡7～13 周，平均孕齡（8.37±1.51）周。本研究經(jīng)孕婦及其家屬知情且同意后，并經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。本研究觀察組患者經(jīng)過我院相關(guān)診斷后，均被確診為自然流產(chǎn)，各項(xiàng)癥狀和指標(biāo)均符合自然流產(chǎn)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，剔除有創(chuàng)傷、發(fā)熱或子宮腫瘤等明顯流產(chǎn)誘因的患者。

1.2 方法

1.2.1 流產(chǎn)組織DNA提取 取大概2 mg樣本采用離心柱法提取DNA，并將DNA濃度標(biāo)定為50 ug/μL。

1.2.2 染色體核型分析 取絨毛組織，用肉眼仔細(xì)剔除蛻模組織和血塊，并用0.9%的生理鹽水對組織進(jìn)行多次清洗，對其進(jìn)行短期培養(yǎng)，5 天后收獲細(xì)胞，用胰酶（0.25%）處理細(xì)胞，并進(jìn)行離心處理（2000 r/min）,之后使用標(biāo)準(zhǔn)的低滲液處理15 min，最后固定處理，再次離心后，取下層，再次固定，制作標(biāo)本，進(jìn)行染色體核型分析。

1.2.3 MLPA檢測 ①探針雜交處理:提取絨毛組織基因組DNA，配置成濃度為50 ng/μL，取5 μL置于PCR反應(yīng)管，進(jìn)行變性處理，溫度為98 ℃，變性5 min后，進(jìn)行降溫，降至室溫后，加入3 μL探針混合液，搖勻后升溫至95 ℃，處理1 min后，降溫并維持溫度為60 ℃，進(jìn)行雜交，時(shí)間為16 h。②連接產(chǎn)物的制備：取32 μL連接液，置于54 ℃熱循環(huán)儀中，混勻后反應(yīng)15 min，并高溫進(jìn)行滅活處理，將制取的連接產(chǎn)物置于4 ℃保存。③PCR擴(kuò)增：取10 μL PCR加入制備的連接產(chǎn)物中進(jìn)行混合，混勻后進(jìn)行擴(kuò)增，儀器為PCR熱反應(yīng)儀，實(shí)行常規(guī)擴(kuò)增循環(huán)，最終孵育出產(chǎn)物。④對產(chǎn)物進(jìn)行檢測：取1 μL的PCR產(chǎn)物與10 μL甲酰胺、0.4 μL的內(nèi)標(biāo)混勻后進(jìn)行電泳分離后，置于95 ℃反應(yīng)5 min，迅速降溫，運(yùn)用毛細(xì)血管電泳對產(chǎn)物進(jìn)行分析和檢測。

1.3 評定指標(biāo) ①檢測成功率：通過運(yùn)用染色體核型分析以及MLPA對66 例流產(chǎn)患者進(jìn)行檢測后，將檢測成功例數(shù)占總例數(shù)的百分比作為檢測成功率。②Ratio值：對分析結(jié)果進(jìn)行對比，當(dāng)Ratio值0.7～1.3 時(shí)表示染色體處于正常，當(dāng)Ratio大小為1.5 左右，表示染色體為3 倍，當(dāng)Ratio值小于0.65 時(shí)表示為染色體為單倍體。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，將Ratio值不在0.7～1.3 范圍內(nèi)的標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得出染色體異常率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料運(yùn)用χ2檢驗(yàn)，各組間差異比較采用方差分析，P＜0.05 表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 染色體核型分析以及MLPA的檢測成功率分析 對66 例標(biāo)本分別進(jìn)行染色體核型分析以及MLPA的檢測后，其檢測成功率分別為74.24%和100%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 染色體核型分析以及MLPA的檢測成功率分析 (例)

2.2 自然流產(chǎn)患者的染色體異常率分析 66 例患 者 的Ratio值 低 于0.65 者2 例，在1.5 左 右 者4例，則染色體異常率為9.09%,與正常組染色體異常率0%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 自然流產(chǎn)患者的染色體異常率分析 (例)

3 討 論

對患者絨毛組織的染色體變異情況進(jìn)行檢測，有助于掌握胎兒在卵裂期之后的發(fā)育情況，能夠在胎兒出現(xiàn)異常的早期就對患者采取適當(dāng)?shù)闹委煷胧虼藢颊叩慕q毛組織染色體異常進(jìn)行分析是研究的重點(diǎn)[3]。

目前，檢測染色體異常最常用的方法為染色體核型分析，但是其存在檢測費(fèi)時(shí)長、培養(yǎng)困難等缺點(diǎn)，導(dǎo)致檢測準(zhǔn)確率降低。隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，MLPA檢測技術(shù)被應(yīng)用于諸多方面，該技術(shù)集合分子雜交、連接和PCR技術(shù)于一體，可同時(shí)檢測出多個(gè)不同的核苷酸。該技術(shù)具有高通量、特異性高、操作簡便、樣本要求低、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[4]。隨著檢測技術(shù)的不斷更新和發(fā)展，將MLPA技術(shù)與基因芯片技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計(jì)出MLPA－微陣列芯片技術(shù)，芯片技術(shù)通過檢測MLPA探針的標(biāo)簽序列來鑒別不同位點(diǎn)的MLPA探針，極大地提高了基因診斷的能力[5]。本醫(yī)院運(yùn)用MLPA對自然流產(chǎn)絨毛組織進(jìn)行染色體非倍體的診斷，得出該技術(shù)的診斷成功率為100%，較常規(guī)染色體核型分析得到明顯提高，運(yùn)用該技術(shù)檢測出自然流產(chǎn)絨毛組織染色體變異率為9.09%,明顯高于正常組。

綜上所述，自然流產(chǎn)絨毛組織的染色體異常是導(dǎo)致胚胎自然流產(chǎn)的重要因素，針對胚胎組織染色體異常且多次自然流產(chǎn)的患者，建議夫妻雙方行染色體檢查，從而為指導(dǎo)下次妊娠提供重要的科學(xué)依據(jù)。