微塑料（MPs）與氟苯尼考復合暴露對普通小球藻的毒性效應研究

高明宇 許曉路 張德勇

【摘 要】對普通小球藻分別進行微塑料、氟苯尼考單獨染毒及聯合染毒96h，結果顯示藻類的增殖收到抑制，96h-EC50值分別為95.58 mg/L和22.82mg/L。染毒組藻類的葉綠素a含量降低、POD酶活力降低、MDA含量升高。聯合染毒實驗則進一步顯示，微塑料與氟苯尼考復合暴露時，具有一定程度的拮抗效應，其毒性效應稍低于單獨染毒的毒性之和。

【關鍵詞】微塑料，氟苯尼考，普通小球藻，淡水綠藻

微塑料（Microplastics，MPs）指直徑小于5毫米的塑料碎片和顆粒，是水體中的新型污染物。預計到2025年全球塑料的產量將達到330億噸，其環境污染問題日趨嚴重[1]。其中相當大比例的塑料，在經歷了一系列化學、物理的反應和聯合作用，就變成體積更小，危害更大，處理難度也更大的MPs。由于MPs顆粒很小，于是很容易被水生生物誤食而攝入體內，對其腸道或組織等造成損傷并影響其生長。MPs可沿食物鏈傳遞，并對許多生物的生長、繁殖、免疫等產生不良影響。MPs還可滲透磷脂雙分子層，影響細胞物質轉運。PS-NH2能破壞細胞膜結構[2 3]，導致血細胞吞噬活性異常，還會改變細胞形態甚至導致細胞死亡[4]。

藻類是水生生態系統中的初級生產者，處于食物鏈的底端同時容易受污染物的影響，其生物量直接決定了食物鏈上游各級生物的維系，對生態系統至關重要。MPs對藻類的毒性可為抑制細胞生長、降低葉綠素含量、引起細胞氧化損傷等，且毒性大小與微塑料的種類、大小、濃度等有關[5-6]。氟苯尼考作為良好的抗菌藥物，在養殖業中大量使用，并被排放到水體環境中，由于其半衰期長，因此可在水體中存在較長時間，是一種廣受關注的污染物。雖然這兩種污染物對藻類的單獨的毒性效應已有不少研究，但是關于二者復合暴露時的復合效應卻尚且罕有研究。實際上，單獨染毒不能反映實際情況，在實際環境中總是許多污染物共同存在時，會彼此影響，使得總體毒性的呈現十分復雜。因此，有必要進行復合毒性的研究，以深入了解環境污染物在實際情況中的復雜效應。對評價污染物對水體環境的危害具有重要的意義。

1、材料與方法

1.1 藻類培養及染毒方案

微塑料采用聚乙烯（PE）粉末;普通小球藻（Chlorella vulgaris）購自中科院水生生物所;“水生4號”培養基由所在實驗室配制;藻類培養條件為25℃、12h/12h光暗循環。單獨及聯合染毒的劑量方案見表1。藻類染毒后繼續培養96h并分析各指標。

1.2 藻類生物量的分析

首先對藻液進行全波長掃描，找出特征吸收峰。然后分別利用吸光度法與顯微鏡計數法建立藻濃度與吸光度值之間的回歸方程。以吸光度作為分析藻類生物量的方法用于各指標分析。

1.3 藻類的生長抑制效應分析及96h-EC50值計算

基于A690值繪制生長曲線，建立抑制率P和濃度的自然對數LnC的線性回歸關系，求解抑制率為50%的濃度值即EC50值。抑制率P（%）=（對照組A690-處理組A690）/對照組A690。

1.4 葉綠素含量測定

藻液用高速離心法提取，加1.5mL乙醇和少許石英砂研磨，轉入離心管定容到10mL，于4℃黑暗提取12h;4000rpm離心10min;上清于比色管中用90%乙醇定容10mL。于比色皿中，測吸光值。葉綠素a濃度（mg/L）=（11.64A633+2.16A645+0.10A630）V1/1000V2。式中V1為提取液定容體積（mL）;V2為濾液體積（L）。

1.5 POD活性測定

藻細胞破壁后，上清充分轉入25mL容量瓶定容。取比色皿加入反應混合液3 mL和酶液1 mL。立即開啟秒表記錄A470，每隔1min讀數1次，共5min。U=（A470×0. 01×W ×t）×樣品稀釋倍數。

1.6 丙二醛（MDA）活性測定

藻液離心后加10%TCA研磨，勻漿液12000rpm離心10min。取2mL上清于試管，加入0.6%硫代巴比妥酸2mL，沸水浴10min。4500rpm離心10min，取上清測吸光度。MDA濃度=6.45（A532-A600）-0.56×A450。

2、結果

2.1 藻類增殖分析及96h-EC50值計算

基于建立的吸光度法分析藻類增殖規律，經計算，微塑料、氟苯尼考對淡水綠藻的抑制率P（%）和濃度的自然對數（LnC）的線性回歸方程分別為：y=0.0633x+0.2111，R2=0.949;y=-0.4574x+19305，R2=0.9616。其96h-EC50值分別為95.58 mg/L和22.82mg/L。

2.2 葉綠素含量

如表1所示，單獨染毒MPs、氟苯尼考均引起葉綠素含量下降，MPs低劑量、高劑量組降幅分別為27.1%和36.5%;氟苯尼考組則分別為39.9%和44.6%。4個聯合染毒組的抑制率均低于相應的單獨染毒組直接相加，故聯合染毒表現出拮抗效應。

2.3 POD的活性

如表1所示，單獨染毒MPs、氟苯尼考均引起POD活力下降，MPs低劑量、高劑量組降幅分別為16.7%和23.5%;氟苯尼考組則分別為48.0%和56.9%。4個聯合染毒組的降幅亦均低于直接單獨組的加和值，呈現拮抗效應。

2.4 MDA含量

如表1所示，單獨染毒MPs、氟苯尼考均引起MDA值升高，MPs低劑量、高劑量組升高率分別為0.25倍和0.41倍;氟苯尼考組則分別為2.3倍和2.6倍。4個聯合染毒組的抑制率均低于相應的單獨染毒組直接相加，故聯合染毒表現出拮抗作用。

3、結論

現在微塑料已經成為了全球性的問題，最近人們在珠穆拉瑪峰上檢測到了微塑料的存在，這也意味著人類在最深處馬里亞納海峽以及地球最高峰上都發現了微塑料的蹤跡，微塑料已成為不可忽視的問題。在2018年的歐洲胃腸病學會議上，維也納的學者首次報告在人體排泄物中檢測到了多達9種MPs，其直徑在50-500 ?m之間，每10克的糞便中就含有20個MPs微粒。微塑料是一種造成污染的主要載體，代表著其不僅具有直接毒性，還可以于其他污染物結合，擴大污染范圍，他們之間的復合毒性效應也亟待深入研究。本實驗中也證實微塑料自身毒性有限，毒性效應不大，但與氟苯尼考聯合染毒時產生一定的協同作用，增強了氟苯尼考對于葉綠素、MDA含量、POD等指標的毒性。

本實驗初步證明了MPs與氟苯尼考單獨染毒均會影響藻類的增殖和生理指標;復合染毒時，葉綠素、MDA含量、POD活力等指標表現出的毒性效應多數弱于單獨染毒直接相加的總合，故可認為符合染毒具有一定的拮抗效應。拮抗效應的機制可能與微塑料具有一定的吸附效應有關。

本研究初步證實了MPs對于藻類有著毒性效應，多種污染物同時作用于藻類時，其呈現的現象是比較復雜的。MPs的毒性機制可以破壞藻類光合作用、抗氧化能力等，但是還有許多內容有待進一步的研究。

參考文獻：

[1]楊杰，李連禎，周倩，李瑞杰，涂晨，駱永明.土壤環境中微塑料污染：來源、過程及風險[J/OL].土壤學報：1-18[2020-11-24].

[2]Lnnstedt OM，Eklv P. Environmentally relevant concentrations of microplastic particles influence larval fish ecology[J]. Science. 2016，352（6290）：1213-1216.

[3]Avio CG，Gorbi S，Milan M，et al. Pollutants bioavailability and toxicological risk from microplastics to marine mussels[J]. Environmental Pollution. 2015，198：211-222.

[4]Collard F，Gilbert B，Compère P，et al. Microplastics in livers of European anchovies（Engraulis encrasicolus，L.）[J]. Environmental Pollution. 2017，229：1000-1005.

[5]Zhang C，Chen XH，Wang JT，et al. Toxic effects of microplastic on marine microalgae Skeletonema costatum：Interactions between microplastic and algae [J]. Environmental Pollution，2017，220：1282-1288

[6]Sjollema SB，Redonda-HasseleRP，Leslie HA，et al. Do plastic particles affect microalgal photosynthesis and growth [J]. Aquatic Toxicology，2016，170：259-261

[7]Mao YF，Ai HN，Chen Y，et al. Phytoplankton response to polystyrene microplastics：perspective from an entire growth period[J]. Chemosphere，2018，208：59-68

作者簡介：

高明宇，1998.10.8，男，漢，浙江杭州，工作單位：浙江樹人大學在讀大學生，研究方向：環境工程。

許曉路，1966.4，男，漢，浙江金華，碩士，教授，研究方向：生態毒理。

張德勇，1978.4，男，漢，山東聊城，博士，教授，研究方向：生物工程。

致謝：本課題受浙江樹人大學“卓越工程師”項目（JZJ0517301）資助。

（作者單位：浙江樹人大學生物與環境工程學院）