一株嗜鹽桿菌對中肋骨條藻的溶藻作用機理研究

韓貝貝，張書飛，吳風霞史榮君黃洪輝

1.中國水產科學研究院南海水產研究所，廣東省漁業生態環境重點實驗室，農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室，廣州510300

2.上海海洋大學水產與生命學院，上海201306

0 前言

近年來，藻華發生頻率增加、規模擴大、危害加劇，已成為一個全球性的環境健康問題[1]。而中肋骨條藻(Skeletonema costatum)作為一種廣溫廣鹽性近岸硅藻，廣泛分布在我國沿海地區，每年在我國沿海都會引發藻華，對海洋生態系統造成嚴重影響。因此，尋求一種有效的藻華治理方法顯得尤為迫切。

海洋中細菌是微生物種群的重要組成部分，與藻類共同調控海洋生態系統的結構和功能[2]。在藻際環境中存在著錯綜復雜的菌藻互作關系，一方面，藻類對細菌生長的促進或抑制:藻類為細菌提供營養物質，促進細菌生長；藻類也可以通過釋放抗菌物質殺死部分細菌[3-4]，或通過抑制細菌的密度感應系統，抑制細菌的代謝[5]。另一方面，細菌對藻類生長的促進或抑制:細菌可以重新礦化藻源物質為藻類的生長提供無機營養和必要的生長因子[6]，包括氮[7]、磷[8]、維生素[9]、鐵載體[10]和生長素[11]等；有些溶藻菌可以直接或間接地抑制藻類的生長，甚至裂解藻細胞。近年來，研究發現，復雜的“藻—菌”關系在藻華的消亡過程中發揮著重要的作用。在藻華末期，溶藻菌的大量繁殖加速了藻華的衰退。溶藻菌的發現為藻華的控制提供了可能途徑，因此，海洋溶藻菌的溶藻作用成為藻華治理領域的研究熱點。

目前，已有大量關于溶藻菌的研究和報道，但關于嗜鹽桿菌的溶藻研究還鮮有報道，以往大多數文獻是關于嗜鹽桿菌的分離與基因組序列分析研究的報道[12-13]，也有文獻報道該屬細菌在微生物工業發酵中的應用[14]等，本實驗室前期從深圳大鵬灣藻華爆發海域分離篩選到了一株嗜鹽桿菌(Halobacillus kuroshimensis，HSQAY1，Genbank 登陸號 JX308828)[15]，該菌株為革蘭氏陽性、桿狀中等嗜鹽細菌，菌落呈圓形、黃橙色[12]。研究發現該菌株的上清液對中肋骨條藻具有強烈的溶藻作用，但對其溶藻作用機理尚不清楚。因此本研究以中肋骨條藻為研究對象，通過研究溶藻作用下中肋骨條藻細胞形態結構、相關生理參數以及與氮代謝、抗氧化系統相關酶活性等的變化，對其中的溶藻作用機理進行了探討，研究結果將拓展我們對藻華過程中“藻—菌”關系的認識，對藻華的生物治理具有重要的科學意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 溶藻細菌及無菌上清液的制備

嗜鹽桿菌菌株HSQAY1于深圳大鵬灣藻華爆發海域分離并保藏[15]。實驗時，用接種環挑取一環菌落接種至100 mL 2216E液體培養基中，28 ℃靜置活化24 h，再以1:100比例接種至2216E液體培養基中，28℃、160 rpm 振蕩培養 48 h，將培養后的菌液以6000 g離心20 min、0.22 μm濾膜過濾并用平板法檢驗無菌后，獲得溶藻菌的無菌上清液(簡稱上清液)。

1.1.2 實驗藻種及培養條件

中肋骨條藻由近海海洋環境科學國家重點實驗室(廈門大學)海洋藻類保種中心提供。藻種經活化后采用 f/2培養基[16]培養，溫度20℃，光照強度100 μE·m-2·s-1，光暗周期 14 h:10 h。

1.2 實驗方法

1.2.1 上清液最適濃度的確定及樣品收集

隨著國家“一帶一路”戰略的實施，中國走向世界的步伐加快，文化的交流也顯得尤為重要，國際學術文化、知識資源的相互交流與促進將成為科技發展的重要推動劑。黨的十九大報告中指出推動文化事業和文化產業發展，推進國際傳播能力建設，講好中國故事，展現真實、立體、全面的中國，提高國家文化軟實力。而國家學術文化、科技文化的發展能夠展現國家科技的實力與水平。

上清液分別按2.5%、5%、7.5%、10%(v/v)添加至指數期的中肋骨條藻藻液中，對照組為未添加上清液的正常培養，另設置一組添加10%(v/v)的2216E培養基。各組每天相同時間取1 mL藻液，盧戈試劑染色后于光學顯微鏡下計數，最終根據細胞計數結果繪制生長曲線，確定最適的上清液處理濃度。

根據上清液最適濃度結果，取指數期的中肋骨條藻藻液，設置3組平行并分別加入5%(v/v)的上清液進行培養，分別收集處理0 h、2 h、12 h、24 h的藻液，其中15 mL藻液用于細胞形態結構觀察、15 mL藻液用于葉綠素熒光測定、4 L藻液經3 μm濾膜過濾，5000 g離心15 min后用于酶活性測定、20 mL藻液采用相同方法收集用于葉綠素a含量測定、200 mL藻液采用相同方法收集用于總氮含量測定。

1.2.2 細胞形態結構觀察

向收集的藻液中加入 0.5%(v/v)戊二醛固定，光學顯微鏡(AX10；Carl Zeiss Meditec AG)下觀察細胞形態結構并隨機選取50個細胞測量其單細胞長度、單細胞直徑以及胞間支持突長度。

1.2.3 總蛋白質、葉綠素a及總氮含量的測定

總蛋白質含量采用總蛋白含量測定試劑盒(南京建成生物工程公司)測定。將藻細胞重懸于生理鹽水，4℃超聲波破碎。細胞勻漿以4000 g、4 ℃離心10 min后取上清液，根據試劑盒操作步驟測定總蛋白質含量。

葉綠素a含量采用甲醇提取法進行測定[17]。向收集的藻細胞中加入5 mL甲醇混勻，4 ℃避光萃取24 h后，7000 g離心5 min取上清，用酶標儀(xMark；Bio-rad)測定上清液在750 nm、665 nm和652 nm波長處的吸光度。葉綠素a含量(μg·mL-1)的計算公式:

其中，A652、A665和A750分別代表上清液在652 nm、665 nm和750 nm處的吸光度，葉綠素a含量的最終結果以每107個細胞中葉綠素a含量表示(μg·107cell-1)。

其中，VMeOH代表甲醇的體積(5 mL)，Vsample代表樣本的體積(20 mL)，X 代表藻細胞密度(cells·mL-1)。

細胞總氮含量參照Abreu等[18]的方法測定。將收集的藻細胞于60 ℃烘干24 h后稱其干重，烘干的樣品于研缽中磨成粉末狀，用35 mm×35 mm的錫紙將樣品包埋并精確稱重之后利用C/H/N/S/O元素分析儀(Vario ELIII；Elemetar Analysensysteme Gmbh)進行測定(%)，最終結果以每 109個細胞中氮含量表示(mg·109cell-1)。

1.2.4 酶活性的測定

將收集的藻細胞重懸于相應勻漿介質中，4 ℃超聲波破碎后細胞勻漿以4000 g、4 ℃離心10 min，上清液即為粗酶液。細胞抗氧化系統相關的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性以及細胞氮代謝相關的硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)及谷氨酰胺合成酶(GS)活性均采用相應試劑盒(南京建成生物工程公司、北京百奧萊博科技有限公司)進行測定。

1.2.5 葉綠素熒光測定

藻細胞光合系統 II(PS II)中的光合熒光效率使用超便攜式調制葉綠素熒光儀(MINI-PAM- II；Walz)測定。將收集的藻液暗處理30 min后測定最大量子產量Fv/Fm。在光化光條件下(光照強度設定為90 μmol·m-2·s-1)測定實際量子產量Y(II)。

1.3 數據處理與分析

數據統計分析采用one-way ANOVA(SPSS 22.0 for Windows)檢驗各個實驗處理組之間的顯著性差異(p＜0.05)。

2 結果

2.1 不同濃度上清液對藻細胞生長的影響

細胞計數結果表明，加入 10%(v/v)2216E培養基的實驗組與對照組的中肋骨條藻生長趨勢無顯著差異(圖1)，表明2216E培養基不影響中肋骨條藻的正常生長。而加入不同濃度上清液的處理組中，溶藻效果隨著上清液濃度的升高而增強，5%(v/v)上清液處理后24 h內中肋骨條藻細胞處于抑制狀態且大部分細胞未破裂死亡，因此本研究選用5%(v/v)的上清液濃度進行后續的實驗。

2.2 溶藻作用下細胞形態結構的變化

正常培養條件下，中肋骨條藻細胞呈鏈狀結構，單細胞呈凸鏡或短圓柱狀(圖2a、2b)。上清液處理2 h后，藻細胞的形態結構與0 h無明顯變化，細胞鏈狀結構及單細胞結構完整(圖2c、2d)。上清液處理12 h后，部分細胞鏈狀結構發生斷裂，細胞多以短鏈或單細胞存在，同時發現少量細胞形成泡狀(圖2e-2h)。24 h后，細胞多以單體存在，少見鏈狀細胞，部分泡狀細胞發生破裂降解(圖2i-2l)。

圖1 不同濃度上清液處理下中肋骨條藻的生長曲線Figure 1 Growth curves of Skeletonema costatum after treated with different amounts of bacterial supernatant

圖2 上清液處理條件下中肋骨條藻細胞的形態結構變化Figure 2 Variation of Skeletonema costatum cells structure after treated with bacterial supernatant

溶藻作用下，單細胞長度、單細胞直徑以及細胞間支持突長度的測量統計結果如圖3所示。上清液處理 2 h后，中肋骨條藻單細胞長度顯著增加(p＜0.01)，12 h 后達到最大值，約為 0 h 組的 2.8 倍。而單細胞直徑和細胞間支持突長度在各處理組間差異均不顯著。

圖3 上清液處理條件下中肋骨條藻細胞的大小變化Figure 3 Cell dimension variation of Skeletonema costatum after treated with bacterial supernatant

2.3 溶藻作用下藻細胞總蛋白質、葉綠素a、總氮含量的變化

上清液處理2 h后，藻細胞內總蛋白質、葉綠素a以及總氮含量與0 h組無顯著差異，而處理12 h和24 h后，藻細胞內總蛋白質含量分別下降 44%和46%(p＜0.01)，葉綠素a含量分別下降48%和56%(p＜0.01)，總氮含量分別下降 41%和42%(p＜0.01)(圖4)。

2.4 溶藻作用下藻細胞抗氧化系統、氮代謝相關酶活性的變化

上清液處理2 h后，細胞內MDA含量與0 h組無顯著差異，而處理12 h后，藻細胞內MDA含量急劇升高，顯著高于 0 h 組(p＜0.01)。處理 24 h 后，藻細胞內MDA含量雖略有下降，但仍顯著高于0 h組(p＜0.05)(圖5a)。T-SOD活性在處理12 h后升高53%，顯著高于 0 h組(p＜0.05)。隨著處理時間的延長，T-SOD活性繼續升高，24 h后活性達到0 h組的1.8倍(圖5b)。POD活性隨處理時間的延長呈逐漸升高的趨勢，各處理組均顯著高于0 h組(p＜0.05)且處理12 h和24 h后活性分別升高至0 h組的5.6倍和6.1倍(圖5c)。

溶藻作用下，各處理組NR、NiR的活性均顯著低于0 h組(p＜0.05)，而GS的活性在處理2 h時無顯著變化，但在處理 12 h及 24 h后均顯著降低(p＜0.01)(圖5d-5f)。

圖4 上清液對中肋骨條藻細胞蛋白質、葉綠素 a、總氮含量的影響Figure 4 The effect of bacterial supernatant on the contents of protein, chlorophyll a and nitrogen of Skeletonema costatum cells

2.5 溶藻作用下藻細胞Fv/Fm、Y(II)的變化

溶藻作用下，各處理組藻細胞的Fv/Fm和Y(II)均顯著低于0 h組(p＜0.01)。處理2 h后，Fv/Fm和Y(II)分別下降 9%和 19%，且隨著處理時間的延長持續下降，處理24 h后，Fv/Fm和Y(II)均下降42%(p＜0.01)(圖6)。

3 討論

3.1 細胞形態結構變化

研究表明，不同種屬的骨條藻細胞在形態上存在一定的差異[19]，相同種屬的骨條藻細胞長度也可能隨生長周期[20]或環境條件的變化而變化[21]。此外，當骨條藻細胞進入分裂期之后，細胞由于受到某些環境脅迫而無法分裂時細胞長度也可能呈現增長的狀態。如中肋骨條藻細胞在UVB紫外線脅迫條件下，細胞無法分裂且處于分裂之前的狀態，從而導致細胞長度變長[22]；Cu2+通過抑制硅藻細胞對硅的吸收利用，抑制細胞分裂，最終使細胞長度增加[23]。類似的，本研究發現，溶藻作用下中肋骨條藻細胞單細胞長度顯著增加，結合細胞計數結果顯示5%(v/v)濃度的上清液處理下，24 h內中肋骨條藻細胞數量處于相對穩定的狀態(圖1)，表明溶藻作用下藻細胞的分裂活動受到抑制。因此，本研究中細胞長度的增加可能是由于溶藻物質抑制了細胞內與細胞周期相關的代謝過程，或直接作用于細胞周期調控相關過程而使細胞周期停止，細胞無法分裂而一直處于分裂前細胞增長的狀態。

3.2 氧化脅迫與藻細胞完整性

圖5 上清液對中肋骨條藻細胞抗氧化系統、氮代謝相關酶活性的影響Figure 5 The effect of bacterial supernatant on the activity of antioxidant and nitrogen metabolism enzymes of Skeletonema costatum cells

圖6 上清液對中肋骨條藻細胞Fv/Fm、Y(II)的影響Figure 6 The effect of bacterial supernatant on the Fv/Fm and Y(II) of Skeletonema costatum cells

活性氧(ROS)是細胞內一類信號分子，在光合生物中主要由光合作用和呼吸作用等代謝過程產生，包括超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫等[24]。細胞內ROS的生成和清除通常處于平衡狀態，但外界條件的刺激可打破這種平衡而使細胞產生過量的ROS，從而引起脂質過氧化，對細胞膜造成氧化損傷，破壞細胞膜的完整性與通透性。如 Liu等[25]發現添加抗生素后，中肋骨條藻細胞內產生過量ROS，破壞了細胞膜的完整性與通透性，導致細胞內 pH增加以及細胞膨脹。Qian等[26]研究了鏈霉素對小球藻和銅綠微囊藻生理指標的影響，結果顯示ROS含量增加的同時MDA含量以及電解液滲透量均增加，表明過量ROS會對細胞造成氧化損傷，致使細胞膜通透性增大?？宗S等[27]同樣發現在溶藻菌無菌濾液處理后，銅綠微囊藻細胞內 ROS含量增加，細胞膜完整性受到破壞，導致細胞內K+和Ca2+外滲。吳培楓等[28]研究發現當東海原甲藻受到溶藻菌 DH-e脅迫后，細胞ROS含量會急劇上升，同時，MDA含量增加，SOD活性增強。管偉城等[29]在溶藻菌 LP-10溶藻機制的研究中也得到類似的結果:LP-10能夠刺激球形棕囊藻細胞產生過量 ROS，細胞內部氧化水平升高，抗氧化系統中的SOD和POD等酶活性出現不同程度的升高，與本文研究結果相似。本研究中，溶藻作用下中肋骨條藻細胞 MDA 含量、SOD和POD的活性均顯著升高。SOD和POD活性的升高表明溶藻物質刺激中肋骨條藻細胞產生了過量的ROS。而MDA含量的顯著升高則說明ROS已對細胞膜內脂質造成損傷效應，因為 MDA 是脂質過氧化的產物之一，也是衡量細胞內脂質過氧化程度的重要指標，間接反映了細胞膜系統的受損傷程度[30]。另外，光學顯微鏡的觀察結果發現，在溶藻作用后期，中肋骨條藻細胞原生質體會在細胞一端形成泡狀并逐漸膨脹破裂(圖2)。因此本研究推測溶藻作用發生的原因之一可能是由于中肋骨條藻細胞的細胞膜受到過量的ROS損傷而通透性發生變化，大量胞外物質進入細胞膜內而使細胞膨脹破裂死亡。相關文獻也有類似的報道[31]。

3.3 溶藻物質對中肋骨條藻細胞氮代謝的影響

氮是浮游植物生長發育過程中的重要營養元素，而硝態氮是藻類利用的主要形式[32]。硝態氮首先通過硝酸鹽轉運蛋白的轉運進入細胞[33]，再通過 NR和NiR的催化轉化為能被細胞直接利用的銨態氮[34]，隨后在 GS等酶的催化反應下完成氨的同化，為葉綠素、核酸和蛋白質等富氮化合物的合成提供原料[35]。在這一系列過程中，NR、NiR和GS是關鍵的調節酶，在氮代謝過程中發揮著重要作用。本研究發現，溶藻作用下中肋骨條藻細胞內 NR、NiR、GS的活性均顯著降低，表明溶藻物質抑制了藻細胞對氮的吸收利用，而這一抑制作用也可能影響了葉綠素、蛋白質等富氮化合物的合成，導致處理組中葉綠素a、總蛋白質以及細胞總氮含量均顯著低于 0 h組(圖4)。此外，有研究發現氮是藻類細胞分裂繁殖過程中的重要元素，因此，本研究中，氮的吸收利用受到抑制也可能是溶藻作用發生的一個原因，溶藻作用下中肋骨條藻細胞氮代謝過程受阻，細胞因缺氮而無法分裂。高越等[36]和Olson等[37]研究也證實了這一點，在氮限制條件下，藻細胞分裂受到抑制，細胞周期停滯于G1期或G2/M期。

3.4 溶藻物質對中肋骨條藻細胞光合系統的影響

光合作用是藻細胞中的重要代謝過程之一，為藻細胞提供有機物質和能量，光合作用的強弱直接影響著藻細胞的正常生長[38]。葉綠素a在光能收集和能量轉換過程中起著重要的作用，常被用來評估藻細胞對環境脅迫反應的程度。Fv/Fm表示藻細胞PS II中的潛在最大光合能力，反映藻細胞最大光能轉換效率，可作為反映光合作用變化的重要指標[39]，而 Y(II)表示藻細胞的實際光合效率。傅麗君等[40]研究發現在溶藻細菌 BS03上清液處理后，塔瑪亞歷山大藻細胞內葉綠素a含量和Fv/Fm隨處理時間的延長和濃度的增加呈逐漸下降趨勢，與本文研究結果相似。本研究中，溶藻作用下，藻細胞的葉綠素a 含量(圖4b)、Fv/Fm 和 Y(II)均顯著下降(圖6)，表明溶藻物質對藻細胞的光合系統可能造成了一定的損傷。研究表明，光化學反應和電子傳遞主要依賴于類囊體上的電子載體以及相關酶的移動，光合作用受類囊體結構和流動性的影響[41]，而過量的 ROS會對光合系統包括類囊體等造成氧化損傷，從而影響藻細胞的光合作用[42-43]。因此，本研究中 Fv/Fm和Y(II)被顯著抑制可能與類囊體膜受氧化損傷而不完整有關，MDA含量的顯著升高也間接地印證了這一推斷。Yang等[24]也認為靈菌紅素是通過破壞銅綠微囊藻類囊體膜的完整性而使光合作用功能受損。此外，氮對藻細胞光合作用中光反應和暗反應的一系列酶的活性也有重要影響，在一定范圍內，藻細胞的光合速率與氮的營養水平呈正相關[44]。因此，溶藻作用下，中肋骨條藻細胞內氮含量的降低也可能是藻細胞光合速率下降的原因之一。

4 結論

本研究以中肋骨條藻為研究對象，通過顯微觀察以及對相關生理參數及酶活性的測定，探討了嗜鹽桿菌HSQAY1對中肋骨條藻的溶藻作用機理。根據本研究結果推測嗜鹽桿菌上清液中的溶藻物質可顯著抑制中肋骨條藻對氮的吸收利用，細胞內蛋白質、葉綠素a等重要生命物質的合成受阻，細胞的正常代謝過程受到抑制，最終細胞分裂活動停止。同時溶藻物質的脅迫刺激中肋骨條藻細胞產生過量的活性氧，細胞膜系統受到氧化損傷而使其通透性發生變化，大量胞外物質透過細胞膜進入細胞內，細胞最終膨脹破裂死亡。