P16INK4A、Ki-67 共表達檢測對宮頸上皮內瘤樣病變的診斷價值

尹璐，鄭磊貞，趙學軍

宮頸上皮內瘤樣病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是宮頸癌前病變的主要疾病狀態，在正常宮頸上皮組織發展到宮頸癌的連續過程中，具有至關重要作用［1］。早期明確、診斷CIN 并準確判斷其病情程度及預后轉歸情況對減少宮頸癌發生和發現早期宮頸癌意義重大。但相關研究表明，CIN 進行組織學診斷時，極易與不成熟鱗狀上皮化生和萎縮及修復性/反應性上皮改變產生混淆現象，導致診斷結果受到影響［2］。近年來，臨床為提高CIN診斷準確性、減少診斷差異，逐漸于輔助診斷客觀指標中引入生物學標志物。其中，P16INK4A（可簡稱為P16）在多種腫瘤組織中通過缺失表達降低或甲基化、突變加快腫瘤疾病發生與進展［3］。Ki-67是一種非組蛋白抗原，屬于核增殖標志基因，研究顯示Ki-67過度表達可對多種腫瘤惡性生物學行為產生密切影響［4］。因此，本研究選取液基細胞學（liquid-based cytology test，LCT）診斷為≥意義不明的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）女性病人作為研究對象，以探討P16INK4A、Ki-67共表達在CIN鑒別診斷中的臨床和經濟價值。具體總結如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取上海市長寧區婦幼保健院2016 年12 月至2018 年8 月收診的經LCT 診斷為≥ASCUS女性病人431例，其中因細胞量不足、細胞學不滿意無法行P16/Ki-67雙染剔除21例，最終有效標本數量為410 例，年齡（49.01±5.84）歲，范圍為21～70歲，病程（1.16±0.14）年，范圍為9個月至3年。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 選取標準

1.2.1 納入標準 （1）均具有明確信息（如年齡、性別、病史等）；（2）年齡范圍為21～70 歲；（3）均經LCT診斷為≥ASCUS；（4）宮頸完整，且未接受過宮頸手術或物理治療；（5）無臨床懷孕疑似癥狀；（6）病人及近親屬理解研究程序，自愿參與，且均簽訂知情承諾書。

1.2.2 排除標準 （1）樣本信息不全者；（2）既往罹患宮頸尖銳濕疣、宮頸息肉等宮頸疾病者；（3）伴有其他宮頸疾病者；（4）處于妊娠期、哺乳期女性；（5）不符合樣本制作要求；（6）同時參加其他臨床研究者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集方法 所有研究對象均由經驗豐富的婦科醫生對其進行常規婦科檢查，同時采集標本，具體采集步驟：采用BD SurePathTM細胞學采樣器（由廣州市寶迪科技有限公司提供）將宮頸脫落細胞標本收集充足，于宮頸口對準宮頸刷尖端，在施加合適壓力條件下同方向旋轉宮頸刷，持續5～8周，盡可能使宮頸刷于宮頸移行帶上刷取細胞，保障獲取充足細胞成分。取出后，將細胞標本放置于富含保存液的細胞保存瓶內，填寫病理報告，于15～30 ℃條件下保存標本，送至病理科檢測。

1.3.2 人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）檢測方法 選擇PCR 毛細管電泳法檢測HPV，采用由寧波海爾施基因科技有限公司提供的貝克曼GeXP 全自動核酸檢測系統進行檢測，操作步驟嚴格按照說明書完成，目的是檢查18種高危型HPV（16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82 型）和7 種低危型別（6，11，42，43，44，81，83）。高危型HPV結果只要有一項為陽性則記為陽性，結果均陰性記為陰性。

1.3.3 LCT 檢查方法 采用BD SurePathTM系統（由廣州市寶迪科技有限公司提供）制備細胞學玻片，具體操作步驟：對標本進行預處理（消化液），以保障獲取足量細胞，保證制作質量。于BD SurePathTM制片機中放置樣本存放瓶，進行程序化制片，之后于乙醇（95%）固定玻片，實行巴氏染色，根據陰道細胞學診斷分類系統（the bethesda system，TBS）報告結果。具體分類：未見上皮內病變細胞和惡性病變細胞（No intraepithelial lesions/malignant，NILM）、不典型腺細胞（atypical glandular cell，AGC）、ASCUS、鱗狀上皮內低度病變（low-squamous intraepithelial lesion，LSIL）、非典型鱗狀上皮細胞，不除外高級別鱗狀上皮內病變（atypical squamous cells not except high lesion，ASC-H）、鱗狀上皮內高度病變（highsquamous intraepithelial lesion，HSIL）、鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC），將ASCUS及以上細胞學診斷定義為細胞學陽性。

1.3.4 P16/Ki-67 單染及雙染方法 P16、Ki67 單染采用免疫細胞化學染色法進行檢測，分別制片后加入鼠抗人P16 和兔抗人Ki67，具體詳細步驟均按照試劑盒說明書操作。P16/Ki-67 雙染檢測采用由羅氏公司提供的全自動免疫組化分析儀（型號為CINtec PLUS），將標本經BD SurePathTM制片后，固定于乙醇中（95%），對標本進行染色，清洗（洗潔精），最后將其封固。由專業檢驗醫師在顯微鏡條件下進行觀察、分析，并將觀察畫面采用拍照形式記錄下來。P16INK4A結果判讀方法為細胞質或（和）細胞核著棕黃色，則判定為P16INK4A呈現陽性表達。Ki-67結果判讀方法為陰性：陽性細胞數＜10%或無陽性細胞；其陽性細胞通常見于細胞核，弱陽性：陽性細胞數10%～25%；陽性：陽性細胞數＞25%～50%；強陽性：陽性細胞數＞50%，于上皮全層彌漫分布。P16/Ki-67 雙染結果判讀方法為將P16 細胞質定義為染色棕色、Ki-67細胞核定義為染色紅色，在同一焦距條件下進行觀察，若結果顯示出特定紅染細胞核、棕染細胞質，則認定為陽性細胞，單個細胞雙染則判定為陽性；同一細胞內僅見1 種顏色或未見兩種顏色則判定為陰性。判讀標準獨立于形態學檢查結果，任何強弱、任何水平表達均可。如圖1，2。

1.3.5 陰道鏡活檢 由經驗豐富的專業醫師進行相關檢查操作，具體操作步驟：于宮頸依次涂抹醋酸（3%）、復方碘溶液（1%），組織標本采集處選擇可疑部位，實行病理活檢。若陰道鏡圖像不滿意，則于宮頸管采取常規搔刮措施，采集后固定組織標本（4%甲醛），實施病理檢查。病理診斷中CIN Ⅱ、CIN Ⅲ（相當于HSIL）及浸潤癌判定為陽性；CIN Ⅰ（相當于LSIL）及宮頸炎癥判定為陰性。

1.4 觀察指標 （1）P16INK4A、Ki-67與HPV感染關聯性。（2）陰道鏡活檢結果。（3）P16INK4A、Ki-67 單染及P16/Ki-67 雙染診斷結果。（4）診斷價值（診斷準確性、敏感性、特異性）。

1.5 統計學方法 運用SPSS 21.0 軟件處理數據，計數資料采用例（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P16INK4A、Ki-67與HPV感染關聯性 Spearman相關性分析，P16INK4A、Ki-67與HPV感染呈正相關（r1＝0.572，P1＝0.005；r2＝0.554，P2＝0.011）。

2.2 陰道鏡活檢結果 經陰道鏡活檢，410 例LCT診斷為≥ASCUS 女性病人中，132 例為陽性病人，占32.20%，其中CIN Ⅱ占34.09%（45/132），CIN Ⅲ占39.39%（52/132），浸潤癌占26.52%（35/132）；陰性病人278 例，占67.80%，其中子宮炎癥占56.83%（158/278），CIN Ⅰ占43.17%（120/278）。

2.3 P16INK4A、Ki-67 單染及P16/Ki-67 雙染診斷結果 P16INK4A單染檢查，陽性144 例，陰性266 例，其中漏診24 例，誤診36 例；Ki-67 單染檢查，陽性143例，陰性267 例，其中漏診27 例，誤診38 例；P16/Ki-67 雙染檢查，陽性168 例，陰性242 例，其中漏診2例，誤診38例。見表1。

表1 P16INK4A、Ki-67單染及P16/Ki-67雙染鑒別診斷宮頸上皮內瘤樣病變410例結果/例

2.4 診斷價值 P16/Ki-67 雙染診斷準確性、敏感性高于P16INK4A、Ki-67 單染（P＜0.05）；P16/Ki-67 雙染診斷特異性與P16INK4A、Ki-67單染相比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 P16INK4A、Ki-67單染及P16/Ki-67雙染鑒別診斷宮頸上皮內瘤樣病變410例診斷價值/%（n/N）

3 討論

近年來我國宮頸癌發病率呈現逐漸上升趨勢，發病人群呈現年輕化趨勢，對女性生命安全造成嚴重威脅，防治形勢嚴峻［5］。宮頸癌通常是因高危型HPV感染而致，其發展過程通常認為需經過宮頸正常上皮組織—宮頸癌前病變—宮頸癌的演變過程，其中宮頸癌前病變CIN 具有至關重要作用［6-7］。臨床為降低宮頸癌發病率，需及早確診CIN，在明確病情程度基礎上采取有效措施治療，控制疾病進展。研究表明，CIN 組織學診斷結果可直接關系到病人病情程度判斷及治療方案制定，對其預后情況具有間接影響［8-9］。

近年來，生物學標志物成為臨床研究熱點。周文俊［10］研究中表明，在CIN、宮頸癌組織中，P16INK4A、Ki-67與HPV感染具有明顯正相關關系。本研究結果也顯示，P16INK4A、Ki-67與HPV感染呈正相關（P＜0.05），表明P16INK4A、Ki-67可隨HPV 感染發生、進展呈現逐漸上升趨勢，在診斷CIN 及宮頸癌中具有一定輔助作用。P16INK4A屬于細胞周期素依賴性激酶抑制物，半衰期較短，可作用于除G0 期外所有細胞周期階段，可將細胞G1 期至S 期進展過程阻斷，從而發揮抑制細胞增殖作用，可達到抑制癌癥的目的，若出現甲基化、突變或缺失表達降低等現象，則可引發腫瘤疾病［11-12］。臨床實踐證實，P16INK4A參與HPV感染而致的宮頸病變進展過程，且具有重要作用［13］。Ki-67 則屬于細胞核內蛋白，與細胞分裂增殖關系密切，可準確反映細胞增殖活性［14］。相關研究表明，Ki-67可有效反映宮頸癌細胞增殖情況［15］。同時，研究顯示Ki-67 過度表達對多種腫瘤疾病預后產生不同程度影響［16-17］。近年來，P16/Ki-67雙染逐漸應用于臨床腫瘤疾病診斷中，若同一細胞內同時檢測出P16INK4A、Ki-67，則標志著細胞周期失調，對檢出真正病變細胞具有明確輔助作用，且不依賴于形態學檢查結果［18-19］。本研究結果顯示，P16/Ki-67雙染診斷準確性、敏感性高于P16INK4A、Ki-67單染（P＜0.05），可見P16INK4A、Ki-67應用于CIN鑒別診斷中，可顯著提高診斷準確性、敏感性，有助于判斷CIN病情程度。

現階段，P16INK4A、Ki-67 在臨床腫瘤疾病診斷中的應用具有一定局限性，主要是由于其檢測過程中所需BD SurePathTM系統、生化分析儀、抗體、試劑盒等一系列相關檢驗設備經濟費用相對較高，加之操作過程相對繁瑣復雜，導致應用受限。但本研究在P16INK4A、Ki-67與CIN分級之間具體關系方面未作詳細探究，需作進一步分析與探討。

綜上可知，P16INK4A、Ki-67 應用于CIN 鑒別診斷中，與HPV 感染具有正相關關系，可在不影響診斷特異性基礎上顯著提高診斷準確性、敏感性，可為臨床判斷CIN 病情程度、制定治療方案等提供有力參考依據，但P16INK4A、Ki-67及P16/Ki-67雙染檢測經濟費用較高，臨床應用受限。

圖1 典型P16/Ki-67雙染陽性細胞（免疫組化雙染染色×400）圖2 典型P16/Ki-67雙染陽性細胞簇（免疫組化雙染染色×400）