血管緊張素Ⅱ調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶9 的表達(dá)在蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)病中的機(jī)制研究

左右，趙慶鎖，羅史科，杜娟

蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）指的是多種原因引發(fā)的血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)致的綜合征，其發(fā)病率較高，病情進(jìn)展快，致殘率和致死率均較高［1-2］。了解SAH發(fā)病機(jī)制，從而對SAH進(jìn)行有效的防治十分重要。血腦屏障損傷是SAH腦損傷的重要環(huán)節(jié)［3］。已有實(shí)驗(yàn)證明，p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）信號(hào)通路在SAH后腦損傷中具有重要作用［4］。而基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡和腦損傷密切相關(guān)［5］。已有研究表明通過p38 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用可調(diào)節(jié)MMP-9 表達(dá)［6］。且有關(guān)于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）可通過激活巨噬細(xì)胞和促進(jìn)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致MMP-9 表達(dá)的升高［7］。但是，關(guān)于SAH 時(shí)是否存在AngⅡ通過激活p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)一步介導(dǎo)MMP-9的表達(dá)調(diào)控在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，本研究于2017年8 月至2018 年6 月從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑探討SAH 時(shí)MMP-9的表達(dá)及作用機(jī)制，旨在確定AngⅡ、MMP-9在SAH 發(fā)病中的作用以及機(jī)制，從而為自AngⅡ、MMP-9干預(yù)途徑防治SAH提供依據(jù)，提高SAH治療水平，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC）株（批號(hào)1000）均購于上海中喬新舟生物科技有限公司，常規(guī)培養(yǎng)于含10%的新生牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中含100 U/mL 的青霉素和鏈霉素，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃、5%二氧化碳，每天以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞株的傳代培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑和儀器 培養(yǎng)基（批號(hào)LM-R1639）均購于上海博升生物科技有限公司，胰蛋白酶（批號(hào)T106942）、青霉素（批號(hào)106339）、鏈霉素（批號(hào)180615-2）購于東恒華道生物科技有限責(zé)任公司，96孔板（型號(hào)TCP011096）購于廣州潔特生物過濾股份有限公司，微量移液器（型號(hào)3120000240）購于德國艾本德股份公司，離心機(jī)（型號(hào)BJ005267）購于德國艾本德股份公司，醫(yī)用恒溫恒濕培養(yǎng)箱（型號(hào)BB15）購于德國Heraeus公司，AngⅡ來源于中國藥品生物制劑檢所，SB203580 p38 MAPK 抑制劑（批號(hào)PF-2341066）購于Adooq Bioscience公司，酶聯(lián)免疫分析儀（型號(hào)ELISA STARlet）購于默飛世爾科技（中國）有限公司，MMP-9 Elisa 試劑盒（型號(hào)JPinChem48T/96T）購于今品化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司，T100 PCR儀（型號(hào)1861096）購于美國伯樂公司，RNA提取試劑盒（型號(hào)R0028）購于碧云天公司，PCR引物購于大連寶生物工程有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（型號(hào)A3500）購于美國Promega 公司，實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒（型號(hào)DRR096A）和SYBR Premix EX Ta（型號(hào)DRR041A）購于日本Takara公司，電泳儀（型號(hào)DYCZ-28）購于北京市六一儀器廠，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）為自配，顯微鏡（型號(hào)13TS100）購于日本Nikon公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 HBMEC 細(xì)胞株分為AngⅡ組、AngⅡ+SB203580 組和對照組。各組細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞懸液濃度為4×103個(gè)/孔，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃、5%二氧化碳，待細(xì)胞生長至60%～70%密度時(shí)進(jìn)行處理。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)處理 其中AngⅡ組以AngⅡ處理，使其最終濃度為100 μg/L，90 min、2 h、4 h、6 h、12 h后取細(xì)胞上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測；AngⅡ+SB203580組以5 μM 的SB203580 處理20 min 后，以AngⅡ處理，使其最終濃度為100 μg/L，90 min、2 h、4 h、6 h、12 h 后取細(xì)胞上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測；對照組加入與AngⅡ組等體積的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)90 min、2 h、4 h、6 h、12 h 后取細(xì)胞上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。各組均重復(fù)3次。

1.3 觀察指標(biāo)和檢測方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組細(xì)胞上清液MMP-9水平 檢測時(shí)間為處理90 min、2 h、4 h、6 h、12 h，將獲取的細(xì)胞液以3 500 r/min轉(zhuǎn)速、3 cm離心半徑進(jìn)行離心5 min，待分層后取細(xì)胞上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測，具體檢測操作嚴(yán)格按照酶標(biāo)儀以及相關(guān)試劑盒的說明書進(jìn)行，由同意ELISA 相關(guān)檢測經(jīng)驗(yàn)豐富者進(jìn)行檢測操作。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞p38 MAPK的mRNA表達(dá)水平 檢測時(shí)間為處理90 min、2 h、4 h、6 h、12 h，常規(guī)獲取細(xì)胞，提取總RNA，以cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）基因?yàn)閮?nèi)參，各引物序列為β-actin：正向：5′-GGCACCCAGCACAATGAAGATCAA-3′；反向：5′-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCTGA-3′。p38 MAPK：正向：5′-TCCAAGGGCTACACCAAATC-3′；反向：5′-TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC-3′。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 s、95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s，共進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算p38 MAPK的mRNA相對表達(dá)量。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細(xì)胞p38 MAPK的蛋白表達(dá)水平 檢測時(shí)間為處理12 h。離心收集細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，添加封閉液體稀釋p38 MAPK 一抗（1∶1 000）2 mL，室溫孵育120 min，PBS洗滌2次。添加封閉液體稀釋二抗（1∶5 000）3 mL，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次。將膜片進(jìn)行電化學(xué)試劑盒發(fā)光，常規(guī)進(jìn)行膠片的曝光、顯影以及定影，通過凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描和分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞上清液MMP-9水平比較 與對照組比較，AngⅡ組各時(shí)間段的細(xì)胞上清液MMP-9 水平升高，AngⅡ+SB203580 組各時(shí)間段的細(xì)胞上清液MMP-9 水平降低（P＜0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+SB203580 組各時(shí)間段的細(xì)胞上清液MMP-9 水平降低（P＜0.05）。見表1。

2.2 三組細(xì)胞p38 MAPK 的mRNA 表達(dá)水平比較 與對照組比較，AngⅡ組細(xì)胞p38 MAPK各時(shí)間段的mRNA表達(dá)水平升高，AngⅡ+SB203580組細(xì)胞各時(shí)間段的p38 MAPK的mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+SB203580組各時(shí)間段的細(xì)胞p38 MAPK 的mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見表2。

2.3 三組細(xì)胞p38 MAPK 的蛋白表達(dá)水平比較以p38 MAPK條帶灰度與β-actin條帶灰度的比值為p38 MAPK 的蛋白表達(dá)水平，對照組、AngⅡ組、AngⅡ+SB203580 組p38 MAPK 的蛋白表達(dá)水平分別為（0.635±0.133）、（0.452±0.105）和（0.276±0.081），三組p38 MAPK的蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝18.762，P＜0.001）。

與對照組比較，AngⅡ組細(xì)胞處理12 h p38 MAPK 的蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.001），AngⅡ+SB203580 組處理12 h 細(xì)胞p38 MAPK 的蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.001）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+SB203580組處理12 h細(xì)胞p38 MAPK的蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.001）。見圖1。

圖1 三組細(xì)胞p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的蛋白表達(dá)

3 討論

SAH 是臨床常見重病癥，其發(fā)病急，無明顯誘因，其病人年齡相對較輕，是嚴(yán)重危害人類健康病癥［8-9］。SAH的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)病理過程及相關(guān)基因，其中炎癥反應(yīng)在SAH中的作用已得到多個(gè)研究認(rèn)可［10］。多種腦細(xì)胞均可合成分泌MMP-9，MMP-9為與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)因子，已有多個(gè)研究證實(shí)SAH的MMP-9水平異常升高，MMP-9參與SAH的發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用［11-12］。

表1 三組細(xì)胞上清液各處理時(shí)間段基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）水平比較/（μg/L，）

表1 三組細(xì)胞上清液各處理時(shí)間段基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）水平比較/（μg/L，）

注：AngⅡ?yàn)檠芫o張素Ⅱ，SB203580示SB203580 p38 MAPK抑制劑。各組均重復(fù)3次。與對照組比較，aP＜0.01；與AngⅡ組比較，bP＜0.001

表2 三組細(xì)胞各處理時(shí)間段p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的mRNA表達(dá)水平比較/

表2 三組細(xì)胞各處理時(shí)間段p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的mRNA表達(dá)水平比較/

注：AngⅡ?yàn)檠芫o張素Ⅱ，SB203580示SB203580 p38 MAPK抑制劑。各組均重復(fù)3次。與對照組比較，aP＜0.05；與AngⅡ組比較，bP＜0.001

隨著關(guān)于SAH 研究的深入，其血腦屏障損傷、腦損傷的危害關(guān)注較多，而腦損傷的發(fā)生不但與炎癥反應(yīng)相關(guān)，亦涉及血管的病變、細(xì)胞死亡等［13］。血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過分泌舒血管物質(zhì)和縮血管物質(zhì)以維持腦血管的正常功能狀況，SAH 發(fā)生后，病人的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生改變，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷的發(fā)生，從而導(dǎo)致舒血管物質(zhì)水平的降低以及縮血管物質(zhì)分泌的增加［14］。AngⅡ?yàn)榭s血管物質(zhì)，廣泛分布在整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)，有AT1R 和AT2R 兩個(gè)亞型，已有研究表明在SAH發(fā)生后AT1R和AT2R表達(dá)的異常，這說明，AngⅡ與SAH的發(fā)生發(fā)展亦可能密切相關(guān)［15］。而腹主動(dòng)脈瘤中，AngⅡ可影響炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致MMP-9 合成分泌的增加［16］。然而目前關(guān)于在SAH 病人中AngⅡ是否可通過影響MMP-9表達(dá)增加而影響病情發(fā)展研究甚少。多種應(yīng)激、前炎癥細(xì)胞因子與生長因子均可激活p38 MAPK，且有研究表明，SAH后炎癥反應(yīng)及血腦屏障損傷均可伴隨p38 MAPK 信號(hào)通路表達(dá)的異常，其在SAH 后早期腦損傷中具有重要作用［17］。是否在SAH時(shí)AngⅡ通過激活p38 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步介導(dǎo)MMP-9 的表達(dá)調(diào)控而影響病情發(fā)展研究甚少。

于沛霞等［18］的研究表明p38 MAPK/MMP-9 通路活性變化與新生大鼠腦缺氧缺血損傷密切相關(guān)。因此，本研究從p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為切入點(diǎn)，探討SAH 時(shí)AngⅡ、p38 MAPK/MMP-9 通路對SAH的影響及其可能機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，添加AngⅡ可上調(diào)HBMEC細(xì)胞株細(xì)胞上清液MMP-9水平和細(xì)胞p38 MAPK 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，而同時(shí)添加AngⅡ和SB203580 p38 MAPK抑制劑則可導(dǎo)致HBMEC 細(xì)胞株細(xì)胞上清液MMP-9 水平和細(xì)胞p38 MAPK 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。提示AngⅡ可能通過激活p38 MAPK 信號(hào)通路而提高M(jìn)MP-9 表達(dá)，影響SAH疾病病程。

綜上所述，AngⅡ調(diào)控MMP-9 表達(dá)的特點(diǎn)為（1）AngⅡ可上調(diào)MMP-9在HBMEC細(xì)胞株細(xì)胞上清液中的表達(dá)水平；（2）AngⅡ可上調(diào)MMP-9 在HBMEC細(xì)胞株細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄層面的表達(dá)水平；（3）AngⅡ可上調(diào)MMP-9在HBMEC細(xì)胞株細(xì)胞中蛋白層面的表達(dá)水平；（4）AngⅡ可能通過激活p38 MAPK 信號(hào)通路上調(diào)MMP-9 表達(dá)；（5）AngⅡ上調(diào)MMP-9 表達(dá)可促進(jìn)SAH 發(fā)生發(fā)展。因此，AngⅡ調(diào)控MMP-9表達(dá)的意義為（1）抑制AngⅡ可能為SAH 防治途徑之一；（2）p38 MAPK 信號(hào)通路干預(yù)可能通過抑制AngⅡ?qū)MP-9的調(diào)控作用控制SAH發(fā)生發(fā)展；（3）MMP-9 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的檢測可能有助于了解其病情發(fā)展?fàn)顩r。