NUDT15 基因多態性與云南省彝族兒童急性淋巴細胞白血病相關性研究

楊春會，段紹琴，崔婷婷，林云碧，宋春艷，雷慶齡，桑寶華，呂瑜，馮俊，田新

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是B系或T系淋巴細胞在骨髓內異常增生的惡性腫瘤性疾病。在第八版兒科學中指出，ALL在我國小兒惡性腫瘤中是最常見的，不到10歲的小兒白血病的發生率為3/10 萬～4/10 萬，發病高峰期是2～5 歲，且男性發病率高于女性［1］。ALL 兒童在出生時的免疫功能是不同的，對感染的反應也是異常的［2］。ALL 的治愈率越來越高，但是大約有15%～25%的病人痊愈后會復發［3］，這也是復發兒童死亡的原因之一。另外，由于化療或藥物耐藥性，部分ALL病人在治療的過程中出現毒性反應，導致不良后果［4］。

ALL 維持治療階段，運用最多的核酸酶類似物藥物為巰基嘌呤（6-MP）［5］。6-MP已被用于治療多種兒童自身免疫性疾病，如炎癥性腸病［6］和某些白血病［7］。中斷6-MP 的維持治療會導致復發風險的增加［8］，適當劑量的6-MP可顯著提高ALL病人的生存率，但是劑量大的6-MP會引發骨髓抑制現象［9］。因此，臨床上合理的調整6-MP用藥劑量很重要。有人提出運用磁性分子印跡納米顆粒聚合物來提取和測定人血漿中6-MP及其活性代謝產物的濃度，這對6-MP治療ALL的臨床使用劑量有很好的指導作用［10］。

NUDT15等位基因的變異與ALL的發生發展有密切的關系。NUDT15基因的遺傳變異影響藥物的水解作用，因此增加了對藥物毒性的敏感性［11］。在日本7歲以下具有NUDT15等位基因變異的ALL病人中，6-MP的平均給藥劑量低于野生型純合等位基因的病人。Cheng等［12］提出，低劑量的6-MP維持治療可引起NUDT15純合突變體（TT基因型）ALL病人的造血毒性。NUDT15 rs116855232（c.415C＞T）變異是白細胞減少癥的預測因子，也是中國ALL兒童6-MP耐受的最佳預測因子［9］。但是，NUDT15變異與云南省彝族ALL兒童是否有關聯仍是未知，因此，本研究的主要目的是確定云南省彝族ALL 兒童病人中NUDT15變異的頻率，并確認其關聯性。此外，確定NUDT15變異與6-MP敏感性和毒性的關聯性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 TIANquick Midi Purification KiT（北京TIANGEN 生產，貨號：DP204-02），DNeasy Blood＆Tissue KiT（德國QIAGEN生產，貨號：69504），2×Taq PCR MasterMix 2%（北京TIANGEN 生產，貨號：MT201-01），5×TBE Buffer（北京TIANGEN生產，貨號：RT205），電泳相關試劑（北京TIANGEN生產）。

1.1.2 主要實驗儀器 主要的實驗儀器有PCR 擴增儀（美國BIO-RAD公司，型號：T100），基因測序儀（美國ABI 公司，型號：ABI-3130xl），凝膠成像系統EC3（美國UVP 公司，型號：EC3 Imaging System），紫外分光光度計（美國Beckman公司）。

1.2 樣本采集及儲存 本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。選取標準：（1）參照中華醫學會兒科學分會血液學組制定的兒童ALL 診療建議確診［13］；（2）監護人自愿參與此次研究。健康兒童以3代以上無血緣關系的在昆明醫科大學附屬兒童醫院體檢健康兒童作為研究對象，ALL 病兒來自昆明醫科大學附屬兒童醫院200例病兒。所有參與此次研究的健康體檢者及200 例病兒均于2017年1月至2018年9月期間收錄在昆明醫科大學附屬兒童醫院，并記錄了研究對象的性別、年齡，民族、身份證信息。此次研究從健康體檢者組及病兒組各按抽簽法隨機選取50例漢族健康兒童、彝族健康兒童和彝族初發的ALL 病兒（1～16 歲）的外周靜脈全血樣本。每個研究對象抽取3 mL外周血，然后輕輕搖動真空采血管，使血樣本與管內的抗凝劑充分混勻，編號后置于－80 ℃超低溫冰箱里儲存備用。

1.3 DNA 提取 提取過程按照DNeasy? Blood＆Tissue KiT使用說明書操作，然后將提取得到的基因組DNA收集于離心管中，置于－20 ℃凍存備用。

1.4 DNA樣本的檢測 取出凍存的DNA樣本于碎冰中解凍，然后通過紫外分光光度計檢測DNA樣本純度，DNA 純度＝OD260/OD280（OD 為被檢測物吸收掉的光密度，即吸光度；OD260/OD280比值指260 nm和280 nm下吸光度比值），當OD260/OD280結果顯示大于2.0，表示樣本中可能有DNA降解為RNA；當OD260/OD280 結果顯示小于1.8 時，表示樣本中蛋白質含量較高；當OD260/OD280結果顯示介于1.8～2.0，表示DNA較純，其純度合格，可用于測序。

1.5 NUDT15 基因1-3 號外顯子進行PCR 擴增運用Primer5 在線軟件設計PCR 擴增引物，NUDT15外顯子（Exon）1 的引物序列：正向為5′-CAAAGCACAACTGTAAGCGACT -3′，反向為 5′ -GAAAGACCCAGCTAGCAAAGAC-3’；Exon3 的引物序列：正向為5′-AAGCAAATGCAAAGCATCAC-3′，反 向 為5′ -GGCTGAAAGAGTGGGGGATA -3′ 。NUDT15 Exon1 PCR 反應體系為25 μL，包含2×GC Buffer 12.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，LA Taq 酶0.25 μL，正向引物（20 μmol/L）0.5 μL，反向引物（20 μmol/L）0.5 μL，DEPC水6.25 μL，DNA模板1 μL（約100 ng），擴增條件是94 ℃3 min；94 ℃30 s，64 ℃30 s，72 ℃1 min，循環36次；再延伸72 ℃5 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往上海生工生物公司進行測序。NUDT15 Exon3 PCR 反應體系為25 μL，包含10×Buffer 12.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，rTaq 酶0.125 μL，正向引物（20 μmol/L）0.5 μL，反向引物（20 μmol/L）0.5 μL，DEPC 水18.375 μL，DNA 模板1 μL（約100 ng），擴增條件是98 ℃1 min；98 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，循環36次；再延伸72 ℃5 min。

1.6 PCR 產物提純 取5 μL PCR 產物于八連管中，加入1 U 蝦堿酶（SAP）及6 U 核酸外切酶I（Exo I），混勻；37 ℃孵化15 min；80 ℃孵化15 min；置于25 ℃（室溫）；吸取10 μL PCR 產物，加入2 μL 的溴酚藍，徹底混合后添加1.2%的瓊脂糖凝膠至加樣孔中，進行電泳，電泳時間為40～50 min，電壓為恒壓100 V，電泳結束后取出膠板，運用凝膠成像系統進行結果的觀察。

1.7 DNA測序 測序引物序列［14］：Exon1的引物序列為5′-CAAAGCACAACTGTAAGCGACT-3′，Exon3的引物序列為5′-AAGCAAATGCAAAGCATCAC-3′。混合反應液：2 μL Big Dye3.1混合物，2 μL 0.4 μM的測序引物，1～2 μL純化的PCR產物。反應條件：96 ℃1 min；96 ℃10 s，50 ℃5 s，循環28次；60 ℃4 min。

1.8 臨床記錄 初發ALL 病人，采用CCLG-ALL 2008方案（China Children Leukemia Group ALL 2008方案）或CCCG-ALL 2015 方案（China Children Cancer Group ALL 2015 方案），在早期強化、鞏固、延遲強化、維持治療過程中，均需應用6-MP 進行治療。在治療的過程中出現的發熱、中性粒細胞減少、白細胞降低、血小板減少、感染性休克等判斷骨髓抑制，記錄發生的時間及程度。

1.9 數據整理與分析 記錄漢族健康兒童、彝族健康兒童及彝族ALL病人的基因測序結果，然后在基因測序儀上對結果進行統計分析，并運用Polyphred軟件進行SNP（單核苷酸的多態性）和突變分析。

2 結果

2.1 150例研究對象的NUDT15基因1-3號外顯子基因的Exon2 均未檢測到 我們對病人計劃進行每天50 mg/m2的6-MP 治療：當白細胞1.5×109/L～3.0×109/L，中性粒細胞1.0×109/L～1.5×109/L時，按正常劑量；當白細胞1.0×109/L～1.5×109/L，中性粒細胞0.5×109/L～1.0×109/L時，6-MP的劑量減半；當白細胞＜1×109/L，中性粒細胞＜0.5×109/L，血小板＜50×109/L 時，停止6-MP 的治療。我們對病人采集的外周血進行NUDT15基因1-3號外顯子基因的測序，結果發現這150 例研究對象的NUDT15 基因1-3 號外顯子基因的Exon2均未檢測到。

2.2 150 例兒童的NUDT15 Exon1 均有2 種變異體 入選的150例來自云南省兒童年齡均介于1～16歲，對NUDT15 Exon1 進行測序后發現所有兒童都有2 種變異體，分別為rs186364861（c.416G＞A，編碼p.Arg139His），rs554405994（c.36_37insGGAGTC編碼p.Val18_Val19insGlyVal）（見表1）。其中云南省彝族的健康兒童：男孩有32 例，女孩有18 例，rs186364861 有1 例（男孩），占2%，rs554405994 有11例（7例男孩，4例女孩），占22%，正常無突變的野生型有38 例，占76.0%。云南省漢族的健康兒童：男孩33 例，女孩17 例，rs186364861 有1 例（男孩），占2%，rs554405994 有6 例（4 例男孩，2 例女孩），占12%，正常無突變的野生型有43 例，占86%。云南省彝族ALL兒童：rs554405994有8例（3例男孩，5例女孩），占16%，rs186364861 有1 例（女孩），占2%，正常無突變的野生型有41例，占82%。

表1 云南省兒童150例NUDT15 Exon1測序結果/例

2.3 NUDT15 各基因型所占比例差異性大 入選的150例兒童的NUDT15 rs116855232等位基因為T/C，各基因型所占比例CC＞TC＞TT，具體的病人數見表2。云南彝族健康兒童的純合子突變TT 基因型只有1例男孩，其占2%；雜合子突變TC基因型一共有7 例，其中女孩是3 例，男孩4 例，占14%；野生型CC 基因型共有42 例，占84%。云南漢族健康兒童的純合子突變TT基因型共0例，占0%，雜合子突變TC基因型共11（女孩4例，男孩7例）例，占22%，野生型CC 基因型39 例，占78%。云南彝族ALL 兒童的純合子突變TT基因型的是1例女孩，占2%；雜合子突變TC 基因型共有9 例：女孩3 例，男孩6 例，占18%；野生型CC基因型共有40例，占80%。

表2 云南省兒童150例NUDT15 rs116855232等位基因突變率/例

2.4 ALL病人在6-MP治療階段，出現不同程度的不良反應 不良反應有發熱、白細胞降低、中性粒細胞減少、血小板減少、感染性休克等骨髓抑制現象。結合臨床癥狀，我們發現：ALL 病人在接受6-MP 常規劑量治療后，存在NUDT15 基因純合突變TT 病人的骨髓抑制現象是最嚴重的，雜合突變CT病人有中度至重度的骨髓抑制現象，而NUDT15 基因野生型CC病人的骨髓抑制現象是最輕的。

3 討論

NUDT15編碼一種Nudix水解酶超家族的酶，是硫嘌呤活化和毒性的負調控因子。NUDT15突變會影響嘌呤類似藥物的反應［15］，導致硫嘌呤代謝不良，并與硫嘌呤誘導的早期白細胞減少有關。6-MP與甲氨蝶呤（MTX）的結合是兒童ALL 維持治療的重要組成部分［16］。但是，治療劑量不合適時會引起不良反應，如骨髓抑制、肝毒性、嘔吐和食欲不振，也會增加患白血病的風險［17］。在本研究中，病人出現的不良反應，主要有發熱、白細胞降低、中性粒細胞減少、血小板減少、感染性休克等骨髓抑制現象。為了減少6-MP的不良反應，對不同等位基因型的病兒進行了劑量的調整。

6-MP的毒性與NUDT15遺傳多態性有關［17］，具有特定等位基因突變的病人需調整劑量，特別是純合突變基因型的病人。在ALL 治療中，NUDT15 與6-MP聯合使用會避免6-MP誘導的白細胞減少有關的炎癥性腸病的發生，這與NUDT15種系變異（如錯義SNP：rs116855232，誘導R139C）有關。這些變異表現出種族特異性，例如，rs116855232 的變異等位基因在東亞和西班牙人中較高，但在高加索和非洲人中較低［18］，因此，可通過整個基因篩選來確定硫嘌呤的初始劑量。在本研究中，我們觀察了6-MP的毒性并評估了云南省彝族兒童6-MP 耐受性與NUDT15 變異之間的依賴關系。研究對象均根據CCLG-ALL 2008 方案或CCCG-ALL 2015 方案進行治療。在維持期間，根據血象調整6-MP劑量。維持治療階段，6-MP 計劃每天50 mg/m2，白細胞為1.5×109/L～3.0×109/L，中性粒細胞為0.5×109/L～1.5×109/L。服用6-MP 后白細胞減少，6-MP 劑量調整：CC（野生型）下調65%～95%；TC（雜合型）下調60%～80%；TT（純合型）下調25%～40%，以維持白細胞數為1.5×109/L～3.0×109/L，中性粒細胞數為0.5×109/L～1.5×109/L左右。

NUDT15 是亞洲人群中潛在的6-MP 敏感性的主要因素之一，NUDT15 rs116855232純合突變會增加早期病人白細胞嚴重減少的發生率［19-20］。本研究中，我們發現50例ALL病兒中，有1例是純合的，9例是TC 雜合子突變。有人提出基因NUDT15 突變是ALL兒童中6-MP骨髓毒性的重要影響因素［21］，進行NUDT15基因檢測對ALL個性化治療具有重要的臨床意義，結合本研究結果，我們發現接受6-MP常規劑量治療的ALL病人中存在NUDT15基因純合突變TT 的病人，其骨髓抑制現象是最嚴重的，雜合突變CT 病人則出現中度至重度骨髓抑制現象，而NUDT15基因野生型CC的病人出現的骨髓抑制現象最輕。但是，在50例云南省彝族兒童ALL病人中，純合子突變TT基因型僅1例（女孩），占2%，雜合子突變TC基因型共9（女孩3例，男孩6例）例，占18.0%，而在彝族健康兒童中，純合子突變TT基因型1例（男孩），占2%，雜合子突變TC基因型共有7例，分別是女孩3例和男孩4例，占14.0%，二者差異無統計學意義，因此，在云南省彝族兒童ALL病人中NUDT15基因突變的敏感性低，NUDT15基因不適合云南省彝族兒童作為6-MP不良反應的相關檢測基因。