高效液相色譜測定兒童體內霉酚酸血藥濃度

許澤君，孫芳，景霞

嗎替麥考酚酯在1995 年被美國食品和藥品管理局批準應用于腎臟和心臟移植，并取得了良好的效果［1］。后來作為新型免疫抑制劑在臨床應用廣泛［2］。由于它的腎毒性較小［3-5］，常用于兒童腎病綜合征等免疫缺陷疾病的治療。嗎替麥考酚酯進入體內之后，迅速水解成霉酚酸，發揮免疫作用。在病兒服藥后，由于個體差異，在相同劑量下，霉酚酸的血藥濃度相差較大［4］，因此，需要定期監測并及時調整服藥劑量，提高臨床療效。目前霉酚酸的血藥濃度測定方法主要包括免疫法、高效液相色譜法及液相-質譜聯用法等［6-11］。其中高效液相色譜法較為經濟、便捷，檢測結果不受代謝物的影響。本研究建立了高效液相色譜法測定兒童血漿中霉酚酸的濃度，并以此監測腎病綜合征病兒的血藥濃度。雖然此法已有若干報道［12-15］，但這些報道均存在一些不足，有的方法使用緩沖鹽溶液作為流動相，可能對儀器或色譜柱造成損傷；有的方法未選擇內標或者內標存在著被其他藥物干擾的可能；還有部分方法的血樣處理過程相對復雜。本研究于2017 年11月至2018年4月建立的方法對這些問題加以改善，使高效液相色譜測定兒童血漿中霉酚酸的濃度更加簡潔、方便。

1 材料

1.1 藥品與試劑 霉酚酸標準品（純度大于98%，Lot.086M4010V，SIGMA）；萘啶酸標準品（純度99.0%，Lot107089，Dr.Ehrenstorfer）。甲醇、乙腈為色譜純；純化水由南京醫科大學附屬兒童醫院自制。空白血漿由南京醫科大學附屬兒童醫院提供。

1.2 儀器 Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀（G1312B二元泵，G1316A柱溫箱，G4212B二極管陣列檢測器），十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo，MS205DU），Vortex-5 渦旋振蕩器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司），abbott 離心機（德國hettich公司）。

2 方法與結果

2.1 檢測條件 色譜柱Agilent Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相為0.1%三乙胺溶液（用10%磷酸調節PH 為3.5±0.1）-乙腈＝60∶40；流速為1.0 mL/min；柱溫為25oC；檢測波長為215 nm，進樣量為40 μL。

2.2 溶液的配制 對照品溶液：精密稱取霉酚酸標準品12.5 mg，到25 mL 容量瓶加甲醇到刻度，然后超聲震蕩2 min。置于-30oC 冰箱內保存。內標溶液：精密稱取萘啶酸標準品3.6 mg，到100 mL 容量瓶加甲醇到刻度，然后超聲震蕩2 min。置于-30oC冰箱內保存。

2.3 樣品處理 精密吸取血漿樣品200 μL 置于1.5 mL 離心管中，加入20 μL 內標，加入甲醇400 μL，渦旋震蕩5 min 后，10 800 r/min 離心8 min，取全部上清液，加入5 μL 5%的磷酸水溶液，渦旋震蕩1 min 后，10 800 r/min 離心8 min。吸取上清進樣。

2.4 方法專屬性試驗 將空白血漿（不含內標），病兒服藥后的血漿（含內標）按“2.3”處理后，在“2.1”色譜條件下，進樣，得色譜圖（圖1）。可見血漿內源性物質的保留時間在3 min 左右，內標萘啶酸的保留時間在8.1 min 左右，主峰霉酚酸的保留時間在12.8 min左右，無雜質峰干擾，各個峰分離度及峰形良好，空白血樣在霉酚酸和萘啶酸色譜峰位置無吸收。

圖1 空白血漿（A）和病兒血漿（B）高效液相色譜圖

2.5 標準曲線 取對照品溶液適量，用空白血漿等比稀釋，配制成濃度為0.20，0.39，0.78，1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL 的系列血漿樣品，按照“2.3”項下方法處理后進行測定。以對照品與內標的峰面積比（Y）和對照品濃度（X）作線性回歸，得回歸方程Y＝0.340 3X-0.003 6，r＝0.999 6。

2.6 方法回收率和精密度 配制0.39，25.00，50.00 μg/mL 高、中、低3種濃度的血漿樣品，每一濃度1 d內按“2.3”項下方法平行操作5次；連續測定3 d。根據標準曲線，考察對照品的方法回收率及日內、日間精密度（表1）。

表1 回收率及精密度（n＝5）

2.7 生物樣品的穩定性 考察霉酚酸0.39，25.00，50.00 μg/mL高、中、低3 種濃度的血漿樣品在凍融1次，反復凍融3 次，室溫放置12 h，4oC 冰箱內放置12 h，等不同溫度條件下的穩定性。結果在各個條件下基本穩定（表2）。

2.8 病兒樣本測定結果 根據已報道的有限采樣法［16］，測定南京醫科大學附屬兒童醫院病兒體內霉酚酸暴露量。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，病兒近親屬對研究方案簽署知情同意書。病兒在服用嗎替麥考酚酯分散片（賽可平）2周達穩態后，于清晨服藥前（0 h），服藥后0.5 h和2 h 3個時間點取靜脈血1～2 mL于EDTA抗凝管，立即送實驗室離心，取上清，按照上述的方法檢測濃度。按0～12 h 藥-時曲線下面積（AUC0～12h）＝7.75+6.49×C0+0.76×C0.5+2.43×C2計算。從2017年11月至2018 年4 月，6 個月內共檢測177 例次。其中63 例12 h 內霉酚酸暴露量小于30 mg·L-1·h-1，占35.6%，102例在30～60 mg·L-1·h-1，占57.6%，12例大于60 mg·L-1·h-1，占6.8%。

3 討論

3.1 試驗方法 本研究處理血樣時，采用了二倍體積的甲醇直接蛋白沉淀法，和其他常用的固相萃取法和液-液萃取法相比，該方法成本低，操作簡便，花費時間較短，靈敏度也能滿足臨床樣本測試的需求。然而，處理后發現上清有些許渾濁，對照品峰形較差，后優化方法，經磷酸酸化，離心后進樣，可得到較澄清的上清液和較好的峰形。在流動相方面，我們沒有使用緩沖鹽體系，這樣可以延長色譜柱壽命，簡化流動相配制。選擇萘啶酸作為內標的原因是它在當前的流動相條件下出峰時間適宜，不受其他雜質峰干擾。并且對兒童一般不會使用喹諾酮類藥物，不會造成干擾。

3.2 檢測結果 由于肝腸循環的存在，霉酚酸的谷濃度一般被認為不能很好地反映其在體內的暴露水平。但在一個用藥間隔內多點采血會給病人，特別是兒童病人造成很大痛苦。因此，有限采樣法［17］監測霉酚酸暴露量的方法被較多地采用。由于兒童病人的特殊性，本研究想在一個用藥間隔內多點采血以建立有限采樣法的估算公式較為困難，所以對住院病兒采用了上述三點采血法和相應的估算公式，預估他們體內的暴露藥量。霉酚酸暴露量在腎病綜合征中起最佳作用的范圍尚無定論，按其在移植病人中能起最佳的免疫抑制作用［18］的范圍30～60 mg·L-1·h-1來看，這些病兒有1/3 未能達標，另有6%超過上限，可能增加了不良反應發生的風險。

表2 血漿中霉酚酸穩定性分析（n＝5）

由于門診清晨時需要采血的病人眾多，門診病人如果采3個血樣，可能會造成采血時刻不準確，進而影響預估值的準確性。在統計已測樣本的谷濃度和預估的霉酚酸暴露量之后（表3），我們發現，當谷濃度在＞1.0～3.5 μg/mL［19］之間時，病人霉酚酸暴露量是（42.1±11.4）mg·L-1·h-1，在靶范圍30～60 mg·L-1·h-1之間占比為84%（77/92）。因此，為方便在門診定期監測血藥濃度的病人，可以選擇監測谷濃度是否在＞1.0～3.5 μg/mL之間。如果谷濃度不在這個范圍內，或者病人發生劑量調整時，我們會建議該病兒按有限采樣法，估算更精確的霉酚酸暴露量。

表3 177例次樣本谷濃度和預估的霉酚酸暴露量的統計分析

3.3 試驗總結 本試驗建立了霉酚酸血藥濃度高效液相色譜測定方法。在本色譜條件下，霉酚酸的理論塔板數大于8 000，整個檢測在15 min 左右完成，相關物質保留時間適當。該方法線性關系良好，重現性高，可用于醫院病兒霉酚酸血藥濃度的檢測，為臨床提供可靠的參考，保障合理和安全用藥。但由于項目開展時間較短，經驗不足和兒童群體的特殊性，還需進一步改進病兒霉酚酸暴露量的估算方法，并結合臨床，探索霉酚酸暴露量在不同病種時更合理的范圍。