Beclin1過表達對黑素瘤SK-MEL-2細胞生物學行為的影響

徐艷艷 王久江 張伶 韓昭 牛亮 張建忠 劉釗

李改靜 李小兵 劉晴 劉志軍 李小靜

河北工程大學附屬醫院皮膚科，河北邯鄲 056002

皮膚惡性黑素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）侵襲性強，易發生血液和淋巴管轉移，5年生存率僅為10.9%，黑素瘤細胞的惡性生物學行為是影響患者預后的重要因素［1-2］。Beclin1作為自噬核心復合物關鍵蛋白，被認為是潛在的抑癌基因［3］。前期研究顯示，Beclin1蛋白可能抑制黑素瘤瘤體生長［4-6］，蘇遠婷等［7］發現，黑素瘤組織Beclin1蛋白表達低于黑素瘤周邊的正常表皮細胞。本實驗中我們以上調Beclin1表達水平為切入點，在細胞水平上進一步探討Beclin1對黑素瘤的影響，以期對開發針對惡性黑素瘤的靶向藥物奠定實驗基礎。

材料與方法

一、主要材料

人黑素瘤細胞株A375、SK-MEL-2來自中國醫學科學院細胞庫。Beclin1抗體產自英國Abcam公司；羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶產自美國Abbkille公司；全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠配制試劑盒均為上海碧云天生物技術公司產品；轉染所用質粒pcDNA.3.1/myc-His（-）A、pcDNA3.1-Beclin1質粒均由中國凱基生物有限公司構建并測序，Beclin1基因編號為AF139131.1；轉染試劑Lipo3000為美國Invitrogen公司產品；Transwell小室為美國Corning公司產品；CCK8試劑盒為日本Dojindo Laboratories公司產品。

二、方法

1.細胞準備：取出凍存的人黑素瘤細胞株A375、SK-MEL-2復蘇，在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中常規培養和傳代，培養至2代以上消化吹打混勻成細胞懸液。

2.Western印跡篩選低表達Beclin1的黑素瘤細胞株：取上述細胞懸液離心后棄上清液，37℃消化。取細胞懸液洗滌后裂解細胞，離心15 min，取上清液用BCA蛋白含量檢測試劑盒測定樣品蛋白濃度。取上清液與上樣緩沖液混合后100℃水浴5 min，室溫冷卻，每孔取60 μg樣品上樣，電泳，轉印硝酸纖維素膜，封閉1 h。以3-磷酸-甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參，加入一抗（稀釋比例1∶2 000）孵育Beclin1過夜，加入羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶二抗（稀釋比例1∶6 000）孵育2 h。ECL化學發光和與X線片定影。使用Gel-Pro32軟件對條帶灰度值以Beclin1與GAPDH灰度值比值表示Beclin1的相對表達量。實驗重復3次。

3.細胞轉染及鑒定：取SK-MEL-2細胞懸液培養至密度達到50%～70%時進行質粒轉染。將細胞分為3組，空白組不做處理，陰性對照組轉染pcDNA.3.1/myc-His（-）A，實驗組轉染pcDNA3.1-Beclin1質粒。將3 μg稀釋好的目的質粒和轉染液等量混勻，室溫孵育5 min，加入細胞培養孔中，培養48 h后，G418篩選單克隆細胞。Western印跡檢測各組細胞Beclin1的表達（方法同前）。實驗重復3次。

4.CCK8試劑盒檢測細胞增殖抑制水平：將上述3組細胞培養2周后進行消化、計數，向96孔細胞培養板中每孔接種5×103個細胞。用含10%胎牛血清的培養基培養24、48、72 h；在每個時間節點，棄原培養液，每孔加入含有10 μl CCK8的完全培養基培養3 h，在多功能酶標儀上測定每孔450 nm波長下吸光度（A450值）。繪制增殖曲線，增殖率=不同時間點A450值/初始A450均值×100%。每組設置6個復孔。

5.Tanswell小室法檢測細胞侵襲能力：在Transwell上室加入稀釋融化的Matrigel膠，37℃靜置2 h，將上述3組細胞饑餓培養24 h后消化、計數。向小室中加入100 μl細胞懸液，細胞數為1×104/室，將小室置入含有500 μl/孔完全培養基的培養板中培養24 h；拭去基質膠和小室內細胞，對小室底部細胞予用0.1%結晶紫染色30 min，PBS洗滌3次，200倍顯微鏡下隨機取3個視野，計數。實驗重復3次。

6.劃痕法檢測細胞遷移能力：取上述3組對數生長期細胞消化接種至6孔板培養12 h，細胞匯合度達60%左右時，為排除細胞增殖引起的誤差，加入適量絲裂霉素培養1 h后換新鮮培養液，培養2 h，然后，用無菌槍頭垂直在6孔板中均勻劃線，PBS洗去漂浮細胞，繼續培養。分別于培養0、24、48 h后拍照，測量細胞遷移距離。細胞遷移距離=0 h劃痕寬度-某時間點劃痕寬度。實驗重復3次。

7.統計學處理：采用SPSS23.0統計軟件分析，實驗數據以±s表示，數據符合方差齊性時，采用完全隨機設計方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、兩株黑素瘤細胞Beclin1表達水平

SK-MEL-2細胞Beclin1相對表達水平為0.037±0.010，明顯低于A375細胞（0.670±0.150），差異有統計學意義（F=46.62，P＜0.05）。見圖1。

二、轉染后SK-MEL-2細胞Beclin1蛋白表達水平

Western印跡檢測顯示，轉染48 h后，3組間Beclin1蛋白表達差異有統計學意義（F=81.38，P＜0.05），其中，實驗組為0.32±0.04，明顯高于空白組（0.07 ± 0.02，t=1.08，P＜0.05）和陰性對照組（0.06± 0.02，t=1.13，P＜0.05），空白組和陰性對照組間差異無統計學意義（t=0.04，P＞0.05）。見圖2。

三、轉染后SK-MEL-2細胞體外增殖能力比較

圖1 Western印跡檢測A375和SK-MEL-2細胞Beclin1蛋白表達 Beclin1蛋白在SK-MEL-2中顯著低表達。GAPDH：3-磷酸-甘油醛脫氫酶

圖2 Western印跡檢測SK-MEL-2細胞轉染后Beclin1蛋白表達 實驗組Beclin1蛋白表達明顯高于空白組和陰性對照組。GAPDH：3-磷酸-甘油醛脫氫酶

重復測量的方差分析顯示，空白組、陰性對照組、實驗組間細胞增殖率差異有統計學意義（F組間=1 077.36，P＜0.05），各組內不同時間點間差異亦有統計學意義（F時間=4 903.04，P＜0.05），組別和時間有交互作用（F交互=205.20，P＜0.05）。培養24、48、72 h時，3組間細胞增殖率差異均有統計學意義（F值分別為1 012.89、10 227.34、13 826.12，均P＜0.05），且隨著時間延長，細胞增殖率逐漸升高，實驗組增殖率低于空白組和陰性對照組（P＜0.05）。見圖3。

四、轉染后各組SK-MEL-2細胞侵襲力比較

Transwell實驗顯示，24 h后3組間每高倍（×200）視野下穿過小室的細胞數差異有統計學意義（F=128.93，P＜0.05），實驗組（18.67±1.19）明顯低于陰性對照組（87.89± 6.05，t=33.53，P＜0.001）和空 白 組（86.78 ± 5.93，t=32.99，P＜0.001）。見圖4。

五、轉染后各組SK-MEL-2細胞遷移活性比較

劃痕實驗顯示，3組間細胞遷移距離在24 h（F=45.25，P＜0.05）和48 h（F=66.66，P＜0.05）時差異均有統計學意義，實驗組在上述時間點均顯著低于空白組（P＜0.05）和陰性對照組（P＜0.05）。見圖5。

討 論

Beclin1蛋白是調控自噬的關鍵標志蛋白［7］，在各種應激因素刺激下，Beclin1和Bcl-2蛋白分離，Beclin1蛋白的結合位點進化保守結構域（ECD）與Ⅲ型PI3K中的亞基Vps34結合，誘導吞噬泡形成，從而啟動自噬［8-10］。研究發現，Beclin1不僅能啟動自噬，Beclin1功能結構域還能和自噬相關調節因子結合，對腫瘤產生抑制作用。

圖3 轉染后SK-MEL-2細胞增殖活性比較 各時間點實驗組細胞增殖率顯著低于空白組和陰性對照組。a：兩組間比較，P＜0.05

圖4 Transwell小室法檢測轉染后各組SK-MEL-2細胞侵襲能力 實驗組穿過小室的細胞數少于其他兩組

圖5 劃痕實驗檢測各組SK-MEL-2細胞遷移活性 5A：顯微鏡下觀察細胞遷移情況；5B：細胞遷移距離統計學比較。實驗組24、48 h遷移能力明顯下降。a：兩組間比較差異有統計學意義，P＜0.05

在前期研究中［4-5］我們發現，丹參酮ⅡA能體外誘導A375細胞自噬，使自噬相關蛋白Beclin1表達顯著升高，同時抑制A375細胞生長能力。隨后在小鼠黑素瘤動物模型中［6］發現，丹參酮ⅡA能使Beclin1表達上調，通過誘導自噬抑制黑素瘤瘤體生長，提示在黑素瘤中Beclin1蛋白可能作為抑癌蛋白存在。本研究中，我們通過Western印跡技術篩選出Beclin1低表達的SK-MEL-2細胞株作為研究對象，通過脂質體轉染法，成功構建Beclin1過表達細胞系，研究Beclin1表達上調對SK-MEL-2細胞惡性生物學行為的影響。結果顯示，Beclin1表達上調后SK-MEL-2細胞增殖能力明顯減弱，侵襲能力下降。但遷移距離可能受細胞增殖的影響，本實驗在劃痕實驗前，預先將細胞經絲裂霉素C處理以排除細胞增殖引起的誤差，結果表明，Beclin1表達上調后，SK-MEL-2細胞遷移能力明顯減低。Hu等［11］發現，Beclin1蛋白過表達可有效抑制舌上皮細胞的增殖和克隆，還發現Beclin1表達下降和晚期腫瘤臨床轉移及預后不良顯著相關。然而有學者提出，在腫瘤化療期間，Beclin1蛋白下調可以增加化療藥物的敏感性［12］。推測這可能與自噬在調控腫瘤的作用中存在階段性有關。

已有研究證實，前列腺癌［13］、結腸癌［14］中Beclin1蛋白低表達。本課題組前期也發現，皮膚惡性黑素瘤組織中Beclin1蛋白表達量明顯低于色素痣組織，Beclin1可能為抑癌基因。祁璘等［15］發現，Beclin1蛋白在宮頸癌表達降低，并提出Beclin1的降低直接促進腫瘤細胞增殖活性。但Bealin1抑制黑素瘤進程的具體機制尚不明確。Beclin1可依賴自噬誘導細胞凋亡、清除受損的基因組和活性氧［16-17］、減少炎癥物質［18］等機制來抑制腫瘤發生和轉移。Wei等［19］提出，Beclin1可有效誘導自噬，抑制腫瘤進程。除了Beclin1依賴自噬發揮抑癌作用，Xu等［20］發現了Beclin1可不依賴自噬，直接與DNA拓撲異構酶Ⅱβ相互作用，抑制腫瘤的發生。Wu等［21］設計出能與Beclin 1卷曲螺旋結構域的C端部分的碳氫化合物靶向作用的結合肽，能通過促進Beclin1自噬核心復合物之間的相互作用，以干擾其同聚體化，誘導自噬，說明以Beclin 1為靶點調控膜介導的自噬和體內運輸可行性。

綜上所述，Beclin1過表達對SK-MEL-2細胞的惡性生物學行為起抑制作用，在黑素瘤中可能起抑癌作用。由于自噬的復雜性和階段性，Beclin1、自噬和黑素瘤之間的具體作用機制還需在后續實驗中進一步探索。本研究選取低表達細胞株時僅測定了兩種細胞株Beclin1表達量，后續將增加細胞株數量并通過干擾Beclin1表達進行反向驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突