氨基酮戊酸-光動力療法對尖銳濕疣組織中血管內皮生長因子和增殖細胞核抗原表達的影響

尹光文 劉聰 王小云 張華 王夢奇

鄭州大學第一附屬醫院皮膚科 450052

尖銳濕疣由人乳頭瘤病毒（HPV）感染引起的常見性傳播疾病，其傳染性強，少數甚至有癌變可能。臨床上缺乏有效的抗HPV感染的藥物，傳統治療方法如激光、冷凍等雖可清除疣體，但不能清除HPV亞臨床感染及潛伏感染，導致治療后復發率高，常給患者帶來較大痛苦，嚴重影響患者生活質量［1］。氨基酮戊酸光動力療法（aminolevulinic acid photodynamic therapy，ALA-PDT）治療尖銳濕疣具有療效好、復發率低、不良反應少、可重復治療和適用于特殊人群等優點［2-3］。我們通過檢測ALA-PDT治療前后尖銳濕疣患者疣體組織中血管內皮生長因子（VEGF）和增殖細胞核抗原（PCNA）的表達變化，探討ALA-PDT對尖銳濕疣組織血管生成和增生的影響。

一、對象與方法

1.對象：2016年10月至2017年9月就診于鄭州大學第一附屬醫院皮膚科門診的56例尖銳濕疣患者。其中，男30例，女26例，年齡19～65（34.55±12.25）歲；病程2周至3個月［（50.32±19.60）d］。男性患者疣體多位于陰莖、包皮、系帶、肛周等部位，女性皮損主要分布在會陰、陰道口等部位。患者均具典型臨床表現，醋酸白試驗均陽性，臨床表現不典型的經組織病理證實符合尖銳濕疣的病理改變。患者均系初次就診，無其他系統性疾病。本研究通過鄭州大學基層倫理審查委員會審查批準（科研快審2016-71），受試者均簽署知情同意書。

2.試劑：兔抗人VEGF多克隆抗體和兔抗人PCNA多克隆抗體產自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，3，3-二氨基聯苯胺顯色試劑盒及過氧化物酶標記的鏈霉親和素（SP）試劑盒產自北京中杉金橋生物技術有限公司。

3.治療方法：將氨基酮戊酸散（復旦張江生物醫藥股份有限公司）充分溶解于0.5 ml滅菌注射用水，配制成濃度為20%的溶液，嚴格按照ALA-PDT的治療方法操作，每周治療1次。治療前以手術刀片取56例尖銳濕疣疣體組織設為對照組。第1次治療后1周，同法取與治療前相同位置的疣體組織作為實驗組。所有標本切除后立即固定24 h，石蠟包埋，制作4 μm厚切片。

4.免疫組化SP法檢測VEGF及PCNA的表達：按試劑盒說明采用免疫組化SP法檢測組織切片角質形成細胞中VEGF及PCNA的表達，以已知染色陽性切片作為陽性對照，用PBS替代一抗作為陰性對照。VEGF陽性表達定位在細胞質，PCNA陽性表達定位于細胞核，陽性表現均為淡黃色至棕褐色顆粒樣物質。評定標準參照相關文獻［4］，對VEGF和PCNA表達綜合染色強度和陽性細胞占總細胞數的百分比進行半定量處理：未著色為0分，淺黃色1分，黃色2分，棕黃或棕褐色3分；陽性細胞占總細胞數百分比≤10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分別對應評分0、1、2、3、4分。2項評分的乘積為總分，總分9～12分為強陽性（+++），6～8分為陽性（++），1～4分為弱陽性（+），0分為陰性（-）。

5.統計學處理：采用SPSS17.0軟件分析實驗數據，分別采用χ2檢驗和秩和檢驗分析治療前后VEGF及PCNA蛋白表達率和表達強度的差異，采用Spearman分析檢驗VEGF及PCNA蛋白表達的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1.ALA-PDT治療前后尖銳濕疣組織中VEGF的表達：見圖1。VEGF表達定位在細胞質，陽性細胞遍布表皮全層，基底層、棘層顯著表達，顆粒層表達漸減弱。ALA-PDT治療前，56例尖銳濕疣患者中40例（71.43%）表達VEGF，表達強度多為++～+++；治療后25例（44.64%）表達VEGF，表達強度多為-～+。治療前后VEGF表達率差異有統計學意義（χ2=8.25，P＜0.05），表達強度差異亦有統計學意義（H=11.29，P ＜ 0.05），見表1。

2.ALA-PDT治療前后尖銳濕疣組織中PCNA的表達：見圖1。PCNA表達于細胞核，分布在表皮的基底層、棘層甚至顆粒層，呈淡黃色至棕褐色。ALA-PDT治療前，56例尖銳濕疣患者中41例（73.21%）表達PCNA，表達強度為++～+++；治療后23例（41.07%）表達PCNA，表達強度為-～+。治療前后PCNA表達率差異有統計學意義（χ2=11.81，P＜0.05），表達強度差異亦有統計學意義（H=12.22，P＜0.05），見表1。

圖1 氨基酮戊酸-光動力療法治療前后血管內皮生長因子（VEGF）、增殖細胞核抗原（PCNA）在尖銳濕疣（CA）組織中的表達（SP法） 治療前，CA組織細胞VEGF表達強度較高，PCNA呈高強度表達；治療后，CA組織細胞VEGF和PCNA表達強度均下降

表1 ALA-PDT治療前后尖銳濕疣組織中VEGF和PCNA的表達強度 例

3.ALA-PDT治療前后尖銳濕疣組織中VEGF與PCNA表達的相關性：治療前后尖銳濕疣組織中VEGF與PCNA表達均呈正相關（rs值分別為0.202、0.273，均P ＜ 0.05）。

三、討論

VEGF是血管形成最強有力的調控因子，其表達降低能夠減少新生血管的生成。有文獻報道，VEGF在尖銳濕疣組織中呈高表達狀態，其表達強度和微血管密度存在明顯聯系［5］。ALA-PDT治療膠質瘤24 h后，VEGF表達逐漸下降，最終抑制血管生成，進而達到抗腫瘤目的［6］。本研究結果顯示，尖銳濕疣組織中VEGF在ALA-PDT治療前高表達，而ALA-PDT治療后表達明顯減少，治療前后差異有統計學意義，推測ALA-PDT可通過降低VEGF表達而抑制血管的生成，這可能是ALA-PDT治療CA的作用機制之一，但具體機制有待進一步研究。

PCNA也是反映細胞增殖活性的指標，參與多種生理過程，是細胞增殖狀態的理想標志物［7］。既往研究發現，尖銳濕疣組織高表達PCNA［8］，表明尖銳濕疣組織角質形成細胞增殖活躍。Xie等［9］觀察發現ALA-PDT治療后24 h，人鼻咽癌裸鼠腫瘤細胞中PCNA表達明顯降低。我們觀察發現，PDT治療后尖銳濕疣組織角質形成細胞中PCNA表達率和表達強度均明顯降低，與Xie等［9］研究結果一致。提示ALAPDT能夠抑制尖銳濕疣組織角質形成細胞的增殖，但其確切機制尚不清楚，推測抑制血管生成可能是ALA-PDT抑制CA組織角質形成細胞增殖的作用機制之一。

有研究表明，尖銳濕疣組織中存在VEGF和PCNA的過度表達，二者表達存在正相關性［10］。本研究結果顯示，ALAPDT治療后尖銳濕疣組織中VEGF與PCNA表達呈正相關，推測ALA-PDT通過抑制VEGF表達來抑制血管生成，進而抑制角質形成細胞增殖，促進尖銳濕疣消退。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突