芍藥苷對人乳腺癌MCF-7細胞增殖、侵襲和遷移的影響及機制研究

汪旭偉， 馬沛， 王建偉， 陳玉星

（南陽市第一人民醫院普外一科，河南南陽 473010）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，對全球女性健康造成嚴重威脅。近年來隨著手術的改進和化療技術的迅速發展，患者的生存率、生活質量和預后有較大進步。但由于部分患者出現復發和轉移，導致治療效果不佳，因此尋找有效治療乳腺癌、降低腫瘤復發率的高效低毒藥物是目前研究的熱點。芍藥苷是從中藥芍藥中提取的一種單萜類糖苷化合物。研究顯示，芍藥苷具有降血糖、心血管保護、神經保護、免疫調節和緩解炎癥反應等多種藥理作用[1-3]，對胃癌、肝癌、結腸癌、皮膚癌、乳腺癌細胞等均有抑制作用[4-7]。已有研究表明，芍藥苷通過抑制Notch-1 信號通路、上皮間充質轉化（EMT）抑制乳腺癌MCF-7 細胞的增殖、遷移和侵襲[7-8]。為進一步探討芍藥苷對乳腺癌的抑制作用及分子機制，本研究觀察了芍藥苷對乳腺癌MCF-7 細胞p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路的影響，旨在為尋找乳腺癌治療的新方法提供實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞及培養人乳腺癌細胞系MCF-7購自上海中科院細胞庫。MCF-7 細胞接種于含體積分數10%胎牛血清的DMEM 培養基中，置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養。

1.2藥物及制備芍藥苷（純度：＞98%；CAS：23180-57-6）購自南京百得生物科技有限公司。芍藥苷溶解于生理鹽水，p38MAPK 通路抑制劑SB203580 溶解于DMSO，0.22 μm 孔徑的濾頭過濾后使用。

1.3試劑與儀器四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Sigma 公司；Ki67、增殖細胞核抗原（PCNA）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、血管內皮生長因子（VEGF）、p38、p-p38、熱休克蛋白27（HSP27）、p-HSP27、GAPDH 等兔抗人一抗購自美國CST 公司。DG5031 酶聯免疫檢測儀購自上海精密儀器儀表有限公司；MDS400光學顯微鏡購自重慶奧特光學儀器有限責任公司；1703940半干轉膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.4MTT法檢測細胞增殖能力取對數生長期的MCF-7細胞，調整細胞濃度至1×104個/mL，每孔接種100 μL 的細胞懸液，培養24 h 后，用含0、5、10、20 μmol/L芍藥苷的培養基繼續培養。芍藥苷0 μmol/L 作為空白對照組，每組設置3 個復孔。培養0、24、48、72、96 h 后，每孔中加10 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續孵育4 h。小心吸去培養液，每孔加入75 μL DMSO，振蕩10 min。于波長為570 nm處應用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸收值。

1.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力將細胞傳代培養于12 孔板中，加入不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的芍藥苷后，用10 μL槍頭垂直于培養板背面直線劃痕。用預冷的PBS洗滌3次后，加入無血清培養液（含10 μg/mL 的絲裂霉素C）進行培養，于0、24 h 進行拍照記錄，并計算劃痕愈合率。公式：劃痕閉合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度。

1.6Transwell 法檢測細胞侵襲遷移能力取無血清培養基稀釋的人工基底膜，加入Transwell 上室，37 ℃風干。取對數生長期的MCF-7 細胞，加入含不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）芍藥苷的無血清培養基。上室中加入200 μL 的細胞懸液，下室中加500 μL 的含血清的DMEM 培養基。于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養24 h 后，棉簽擦去基質膠和上室細胞，多聚甲醛固定后染色。光學顯微鏡下計數并拍照，每個樣本隨機選取5個視野。

1.7蛋白質免疫印跡（Western Blot）法檢測細胞增殖和遷移相關蛋白Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF及p38MAPK 信號通路相關蛋白p38、p-p38、HSP27、p-HSP27 的表達以不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）芍藥苷或芍藥苷（20 μmol/L）+SB203580（50 μmol/L）作用于對數生長期MCF-7 細胞24 h后，收集細胞，加含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，離心后轉移上清。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，15 000 r/min 離心10 min，12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜。用50 g/L 脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗（Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF、p38、p-p38、HSP27、p-HSP27、GAPDH）于4 ℃孵育過夜，加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加電化學發光（ECL）液曝光顯影。使用Image-Pro plus 6.0 軟件分析蛋白條帶灰度值，最終結果以目標蛋白與內參（GAPDH）的灰度值的比值（p）表示。

1. 8統計方法采用SPSS 18.0 統計軟件分析數據。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間差異比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1芍藥苷對MCF-7細胞增殖的抑制作用以0、5、10、20 μmol/L 芍藥苷作用于MCF-7 細胞1、2、3、4 d 后，結果顯示：隨著作用時間的延長，芍藥苷濃度越大，對細胞增殖的抑制效果越明顯（P＜0.01）。表明芍藥苷可抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力。結果見圖1。

圖1 芍藥苷對MCF-7細胞增殖的抑制作用（MTT法）Figure 1 The inhibiting effect of paeoniflorin on proliferation of MCF-7 cells（by MTT assay）

2.2芍藥苷對MCF-7細胞遷移的抑制作用以芍藥苷處理MCF-7 細胞24 h 后，結果顯示：與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L芍藥苷組劃痕愈合率降低（P＜0.01），且芍藥苷濃度越高，劃痕閉合程度越低。表明芍藥苷可抑制人乳腺癌MCF-7 細胞的遷移能力。結果見圖2。

圖2 芍藥苷對MCF-7細胞遷移的抑制作用Figure 2 The inhibiting effect of paeoniflorin on migration of MCF-7 cells

2.3芍藥苷對MCF-7細胞侵襲能力的抑制作用以芍藥苷處理MCF-7 細胞24 h 后，結果顯示：與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L芍藥苷組侵襲細胞數減少（P＜0.01），且芍藥苷濃度越高，發生侵襲的細胞數目越少。表明芍藥苷可抑制人乳腺癌MCF-7細胞的侵襲能力。結果見圖3。

2. 4芍藥苷對MCF-7細胞增殖和遷移相關蛋白Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF表達的影響與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L 芍藥苷組細胞Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF 的表達水平均顯著降低（P＜0.01），且芍藥苷濃度越高，效果越明顯。結果見圖4。

圖3 芍藥苷對MCF-7細胞侵襲能力的抑制作用Figure 3 The inhibiting effect of paeoniflorin on invasion of MCF-7 cells

圖4 芍藥苷對MCF-7細胞增殖和遷移相關蛋白Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF表達的影響Figure 4 The effect of paeoniflorin on the expression levels of proliferation and migration related proteins Ki67，PCNA，MMP-9，VEGF in MCF-7 cells

2.5芍藥苷對MCF-7細胞p38MAPK信號通路相關蛋白p38、p-p38、HSP27、p-HSP27表達的影響各組細胞p38、HSP27蛋白總表達量沒有明顯的變化。與空白對照組比較，芍藥苷低、中、高濃度組p-p38 和p-HSP27 的表達水平明顯上升（P＜0.01），且芍藥苷濃度越高，效果越明顯。結果見圖5。

2.6芍藥苷對MCF-7細胞p38MAPK通路抑制后的相關蛋白p38、p-p38、HSP27、p-HSP27、Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF表達的影響SB203580后，MCF-7細胞中p-p38和p-HSP27表達水平顯著降低，而Ki67、PCNA、MMP-9和VEGF 表達水平均顯著上升（均P＜0.01）。SB203580 與20 μmol/L的芍藥苷共同處理MCF-7 細胞后，結果顯示，細胞中p-p38 和p-HSP27 表達水平顯著上升，而Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF 的表達水平均顯著降低（均P＜0.01）。結果見圖6。

3 討論

本研究結果顯示：不同濃度（5、10、20 μmol/L）的芍藥苷作用于MCF-7 細胞后，隨著給藥濃度和作用時間的增加，芍藥苷可逐漸降低乳腺癌細胞活性，抑制乳腺癌細胞增殖。

圖5 芍藥苷對p38MAPK信號通路相關蛋白p38、p-p38、HSP27、p-HSP27表達的影響Figure 5 The effect of paeoniflorin on the expression levels of p38MAPK pathway related proteins p38，p-p38，HSP27，p-HSP27

圖6 芍藥苷對p38MAPK通路抑制后的相關蛋白p38、p-p38、HSP27、p-HSP27、Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF表達的影響Figure 6 The effect of paeoniflorin on the expression levels of p38MAPK pathway related proteins p38，p-p38，HSP27，p-HSP27，Ki67，PCNA，MMP-9，VEGF

Ki67和PCNA是檢測乳腺癌細胞增殖能力的關鍵指標。Ki67和PCNA的表達水平越高，乳腺癌增殖能力越強[9]。同時Ki67 和PCNA 常用于乳腺癌的分期和預后觀察，對臨床有重要的指導作用[10]。本研究的Western Blot 結果顯示，不同濃度芍藥苷作用于MCF-7 細胞后，細胞中Ki67 和PCNA 的表達水平均顯著降低。與MTT 實驗結果一致，表明芍藥苷可抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖。

腫瘤發生轉移是其難以治愈的重要原因。腫瘤侵襲是一個多階段的過程，包括增殖、粘附和運動，其中細胞外基質和細胞基底膜的降解是侵襲過程中的關鍵步驟[11]。MMP-9 是與腫瘤轉移密切相關的蛋白水解酶，能特異性地降解基底膜的重要組成成分Ⅳ型膠原。MMP-9 降解細胞外基質成分后，有助于細胞遷移。VEGF在乳腺癌腫瘤中呈現高表達，有促進乳腺癌轉移的作用[12-13]。本研究Transwell 實驗結果顯示，MCF-7 細胞經不同濃度芍藥苷處理后，發生侵襲的細胞數目明顯減少。芍藥苷處理后，劃痕閉合程度明顯高于MCF-7 對照組；芍藥苷濃度越高，劃痕閉合程度越低。Western Blot 結果顯示，MCF-7 細胞經芍藥苷處理后，細胞中MMP-2 和VEGF 的表達水平顯著降低。提示芍藥苷可使乳腺癌MCF-7 細胞侵襲和遷移能力降低。

p38 是MAPK 家族中的重要一員，p38 上游的MAPKK 通過磷酸化p38MAPK 使其活化。活化的p38 調控下游多種基因的表達，參與調控細胞生長、分化、凋亡和侵襲等多個生物學過程。在乳腺癌組織中已經發現p38MAPK 磷酸化水平異常降低，而抑制p38MAPK 信號通路后的乳腺癌細胞的生長速度加快，細胞凋亡減少，且影響乳腺癌細胞的遷移[14]。本研究結果顯示，MCF-7細胞經芍藥苷處理后，細胞中p-p38和p-HSP27的表達水平均顯著降低，表明芍藥苷可抑制p38MAPK 通路的激活。

為了進一步證實芍藥苷是否通過p38MAPK 通路降低乳腺癌MCF-7 細胞的增殖、侵襲和遷移，本研究使用SB203580抑制p38MAPK通路，結果發現，p-p38和p-HSP27的表達水平均顯著降低。當SB203580與芍藥苷共同作用于MCF-7細胞后，pp38 和p-HSP27 的表達水平均顯著上升，而Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF 的表達水平均顯著降低。提示芍藥苷可通過激活p38MAPK 通路抑制MCF-7細胞增殖和遷移相關蛋白表達，從而抑制MCF-7細胞的增殖和遷移。

綜上所述，芍藥苷可抑制人乳腺癌MCF-7 細胞的增殖、侵襲和遷移，其機制可能與調控p38MAPK 通路的激活有關。本研究下一步將構建乳腺癌抑制瘤裸鼠模型，觀察芍藥苷對實體腫瘤生長和轉移能力的影響。