酒精性肝硬化患者血CTLA-4和PNPLA3基因多態性及其臨床意義分析*

張 冰,解學軍

酒精性肝硬化是酒精性肝病發展的結果,早期可能無明顯的癥狀。隨著疾病進展,則可出現消瘦,食欲減退,乏力,牙齦出血等癥狀。如疾病進一步惡化,還可出現面部晦暗、肝掌和肝性腦病等,嚴重危及患者生命健康。本病病因與患者長期大量飲酒有關。此外,性別、營養狀態和遺傳因素也是本病的影響因素[1]。最新研究顯示,大量基因位點多態性與酒精性肝硬化的發生有關,如細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4)和Patatin樣磷脂酶3(patatin-like phospholipase domain containing 3,PNPLA3)基因多態性等,其中CTLA-4是免疫球蛋白超基因的一種,主要存在于T細胞表面。CTLA-4即是白細胞分化抗原,也是T細胞跨膜受體,具有傳遞阻止信號和負性調節T細胞增殖等功能[2]。PNPLA3則是Patatin樣磷脂酶家族成員之一,具有磷脂酶和酰基轉移酶活性,同時也是脂質代謝的重要參與因子[3]。既往研究顯示,PNPLA3 rs738409 GG型基因攜帶人群是酒精性肝硬化的高危人群,并且發現該基因不但與脂肪肝形成有關,還與肝臟炎癥和肝纖維化等病理學改變密切相關[4]。本研究分析了110例酒精性肝硬化患者外周血CTLA-4和PNPLA3基因多態性的變化,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017年1月～2019年1月在我院治療的酒精性肝硬化患者110例,男性98例,女性12例;平均年齡為(50.2±9.1)歲。平均每日飲用乙醇量為(65.3±11.3)g,診斷符合酒精性肝病防治指南的標準。納入標準：(1)本地常住漢族人群(居住時間超過1年)。排除標準：(1)合并有糖尿病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、甲狀腺疾病等其他疾病;(2)病毒性肝炎、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病等其他肝病;(3)合并有HIV感染。同時,選擇無肝腎功能異常、糖尿病、高血壓病的不飲酒健康人100例作為對照,男性90例,女性10例;平均年齡為(49.9±9.1)歲。兩組受試者性別和年齡比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 實驗方法 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性檢測血CTLA-4基因rs4675369位點和PNPLA3基因rs738409位點多態性(上海生工生物有限公司),即抽取兩組受檢人員靜脈血各5 ml,采用高鹽法提取外周血基因組DNA,使用美國Thermo公司生產的Nanodrop 2000超微量分光光度計測定DNA濃度和純度,行瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。優先擴增目的基因片段,對應上下游引物(上海生工提供)1.0 μl,10 mM 1.0 dNTP(北京百奧萊博科技有限公司)2 μl,Taq Buffer(美國 Genscript公司)5.0 μl,Taq 酶(上海鈺博生物)0.5 μl,加去離子水至50 μl。PCR 反應如下：95℃預變性5 min,94℃變性30 s,57℃退火60 s,72℃延伸60 s,共35個循環。對反應產物進行瓊脂糖凝膠(北京瑞達恒輝科技發展有限公司)電泳,并于紫外燈下鑒定。使用美國ABI公司提供的3PROSM 3730測序儀對PCR純化產物進行測序,確定樣本基因表型。

1.3 統計學處理 應用SPSS 19.0軟件處理和分析,對符合正態分布的計量資料以(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,CTLA-4基因rs4675369位點基因型和等位基因比較采用卡方檢驗,采用 Hardy-Weinberg平衡法檢驗樣本代表性,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組CTLA-4和PNPLA3基因多態性情況 人CTLA-4基因rs4675369位點基因型有三種,分別為AA、AG和GG型;PNPLA3基因rs738409位點基因型也有三種,分別為CC,GC和GG型。經Hardy-Weinberg檢驗,酒精性肝硬化患者和健康人CTLA-4和PNPLA3基因分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 肝硬化與健康人CTLA-4基因rs4675369位點多態性分布比較 肝硬化和健康人CTLA-4基因rs4675369位點基因型和等位基因比較,差異無統計學意義(P＞0.05,表1)。

2.3 肝硬化與健康人PNPLA3基因rs738409位點多態性分布比較 肝硬化患者PNPLA3基因rs738409位點GG基因型和等位基因G比例顯著高于健康人(P＜0.05,表2)。

2.4 不同CTLA-4基因型肝硬化患者肝功能指標比較 vCTLA-4基因rs4675369位點AA型、AG型和GG型酒精性肝硬化患者血清 ALT、AST、GGT和ALP水平比較,差異無統計學意義(P＞0.05,表3)。

2.5 不同PNPLA3基因型肝硬化患者肝功能指標比較 PNPLA3基因rs738409位點CC型、CG型和GG型酒精性肝硬化患者血清ALT、AST、GGT和ALP水平比較,差異無統計學意義(P＞0.05,表4)。

3 討論

酒精性肝硬化源于不良的生活習慣。因此,積極評估酒精性肝硬化危險人群,并給予健康指導是本病的防治要點。近些年的研究顯示,基因多態性與酒精性肝硬化的發生密切相關,一些研究[5,6]已證實酒精代謝酶、炎癥細胞因子、抗氧化酶等基因或基因組多態性是酒精性肝硬化發生、發展的影響因素,但大部分基因與酒精性肝硬化發病間的聯系還有待進一步研究。

表1 兩組CTLA-4基因rs4675369位點基因型分布(%)比較

表2 兩組PNPLA3基因rs738409位點基因型(%)比較

表3 不同CTLA-4基因型肝硬化患者肝功能指標(±s)比較

表3 不同CTLA-4基因型肝硬化患者肝功能指標(±s)比較

基因型 例數 ALT(U/L) AST(U/L) GGT(U/L) ALP(U/L)AA 型 29 186.0±39.8 130.3±53.3 270.8±87.3 98.8±43.3 AG 型 54 179.4±50.5 127.8±55.2 265.6±90.5 90.2±40.3 GG 型 27 181.8±48.2 133.7±50.4 269.8±89.7 95.2±40.1

表4 不同PNPLA3基因型肝硬化患者肝功能指標(±s)比較

表4 不同PNPLA3基因型肝硬化患者肝功能指標(±s)比較

基因型 例數 ALT(U/L) AST(U/L) GGT(U/L) ALP(U/L)CC 型 45 182.1±40.8 131.3±51.2 274.8±82.3 97.2±41.4 CG 型 46 180.4±49.1 128.9±55.0 267.1±88.4 91.2±42.2 GG 型 19 180.6±45.2 131.6±52.2 271.2±85.4 94.3±41.1

CTLA-4也被稱為CD152,是T細胞活化的負性調節分子之一,其基因定位于人2q31-2q33,大小約為4 kb,含有4個外顯子和3個內含子[7]。CTLA-4胞內端存在由36個氨基酸組成的免疫酪氨酸抑制基序(immune tyrosine inhibitory motif,ITIM)與同源蛋白CD28的免疫酪氨酸激活基序(immune tyrosine activating motif,ITAM)相對。CTLA-4具有高度內吞性,多以同源二聚體形式存在,可在T細胞活化后協同CD28等抑制分子共同負性調節T細胞表達。生化研究顯示,CTLA-4可為T細胞受體募集磷酸酶,并減弱其信號,阻滯T細胞活化。CTLA-4還可從抗原呈遞細胞膜內捕獲、去除B7-1和B7-2,并阻滯其對CD28的激活能力,最終下調T細胞活性。最新研究顯示[8],CTLA-4基因多態性對T淋巴細胞具有不同的抑制程度,GG基因型可顯著減低CTLA-4 mRNA水平,而 AA型可促使 CTLA-4高表達。CTLA-4基因多態性還與IgE合成能力密切相關。AA基因型人群IgE抗體合成能力顯著高于AG或GG型,提示AA基因型或可介導Th2為主的免疫反應。有研究發現[9],在伴自身免疫性疾病的患者,其GG基因型表達水平顯著升高,并且患者CTLA-4 mRNA水平較健康人群更高。還有研究發現[10],CTLA-4外顯子1區域及其啟動子區域位點多態性與原發性膽汁肝硬化的發生密切相關。但在本研究中,酒精性肝硬化和健康人CTLA-4基因rs4675369位點基因型和等位基因比率比較差異無統計學意義,表明CTLA-4基因多態性與酒精性肝硬化發生的聯系還需要研究[11]。本研究血CTLA-4基因rs4675369位點AA型、AG型和GG型的酒精性肝硬化患者血清ALT、AST、GGT和ALP水平比較差異無統計學意義,表明CTLA-4基因多態性與酒精性肝硬化的臨床關系也不明。

PNPLA3基因位于人22號染色體22q13.31處,編碼具有一個非特異性酰基水解酶活性的非分泌型蛋白[12]。PNPLA3存在一段高度保守的Gly-X-Ser-X-Gly水解序列,其活性中心也位于這一序列內[13]。PNPLA3疏水殘基側鏈底物結合凹邊緣存在一個由絲氨酸和天冬氨酸組成的二元體,該二元體是PNPLA3催化效用的重要結構[14]。既往研究顯示[15],PNPLA3基因的非同義序列變異rs738409C＞G是人類肝臟脂肪變性的重要因素,而脂肪變性是酒精性肝硬化患者肝損傷的早期階段,其機制可能與rs738409的非同義序列變異道甘油三酯活性水解活性被抑制,導致大量甘油三酯堆積于肝細胞內有關,這一機制也是非酒精性脂肪性肝病的重要發病機制[16,17]。此外,PNPLA3的G變異還將導致肝細胞脂肪分解功能變化,并因此引發肝組織脂肪堆積[18]。有意思的是,脂肪酸長度及其類型不同,PNPLA3的反應也不同,飽和、單或多不飽和脂肪酸可促使PNPLA3表達水平上升,而長鏈脂肪酸則對PNPLA3表達無明顯的促進作用。有研究發現[19],PNPLA3還可對脂肪細胞表面的特殊位點進行調節,如PNPLA3變體可抑制甘油三酯在細胞間的轉運能力,并增強其脂質過氧化的幾率,增強肝臟氧化應激水平,并以此介導肝細胞炎癥和損傷。PNPLA3基因多態性還可對肝實質細胞外的肝臟細胞數量和活性發生作用,并因此引發肝纖維化,但其機制尚無確切的結論。因此,PNPLA3基因多態性引發的肝組織脂肪存儲、脂肪變性可作為酒精性肝硬化的高危因素。在本研究中,酒精性肝硬化和健康人PNPLA3基因rs738409位點基因型和等位基因比率差異有統計學意義,并且肝硬化患者GG基因型和等位基因G比率分別為16.0%和37.5%,佐證了前述的結論,即提示PNPLA3基因多態性與酒精性肝硬化的發生密切相關。國外研究顯示[20],PNPLA3基因多態性與酒精性肝硬化患者肝組織炎癥水平存在一定的相關性。但本研究發現酒精性肝硬化患者PNPLA3基因rs738409位點CC型、CG型和GG型患者血清ALT、AST、GGT和ALP比較差異無統計學意義,表明PNPLA3基因多態性與酒精性肝硬化患者的病情無顯著關系,可能與本組研究樣本數量較少有關。此外,本研究所取樣本為血清,并未進行肝臟穿刺活檢取樣,或將掩蓋了一些信息。

本研究通過基因分析,發現PNPLA3基因多態性可導致肝組織脂肪存儲或脂肪變性等病理學改變,最終參與酒精性肝硬化的發生和發展,而CTLA-4基因多態性則與酒精性肝硬化發病無明顯的關系。由于本研究例數較少,還存在一些不足,有待我們今后進行多中心、大樣本的研究證實。PNPLA3基因多態性與酒精性肝硬化發病的確切關系,尚需進一步研究。