化濁通瘀湯干預非酒精性脂肪性肝病大鼠血清腫瘤壞死因子-α和瘦素的變化*

郭化磊,卜理琳,裴 穎,殷宏振,黃 峰

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指無過度攝入酒精等引起的肝脂肪積累,經影像學或組織學檢查發現肝脂肪變性的一種疾病,其疾病譜可包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性肝硬化和肝癌[1,2]。流行病學研究顯示,在常見的慢性肝病中,NAFLD發病率已超過病毒性肝炎而成為第一位,嚴重威脅人們的健康,其發病率呈逐年上升并且具有低齡化趨勢[3-5]。NAFLD會增加許多疾病的發病率,如膽道和腸道疾病、高血壓、心腦血管疾病等,并且NAFLD患者患糖尿病風險高于正常人5～9倍[6,7]。目前,NAFLD的發病機制公認的是“二次打擊”學說[8-10],第一次打擊導致單純肝脂肪變性,是由胰島素抵抗(IR)引起肝臟脂質代謝紊亂引起的,其次打擊導致肝細胞凋亡、壞死,是由包括活性氧過剩引起的氧化應激和腫瘤壞死因子(TNF)-α等促炎癥細胞因子損傷引起的。中醫以整體觀念和辨證論治為核心,認為NAFLD主要是由于飲食偏好和過度,損傷脾胃,水濕內停,濁邪內生,加之肥人多氣虛懶動,久坐成瘀,終成濁瘀,其病位在肝,涉及脾、胃、腎[11]。本實驗建立NAFLD大鼠模型,觀察了化濁通瘀湯對動物的干預作用,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與藥品 60只健康SPF級雄性SD大鼠,體質量為(180±20)g,購于西安交通大學醫學部實驗動物中心【合格證號：SCXK(陜)2012-003】,隨意進食水。每日明亮與黑暗各半,室內溫度為(21±1)℃,空氣濕度為(46±5)%。高脂飼料包含10%豬油、5%蛋黃粉、2%膽固醇、0.2%膽酸鈉和82.8%基礎飼料【北京科澳協力飼料有限公司,合格證號：SCXK(京)2014-0010】。化濁通瘀湯由茯苓20 g、丹參15 g、山楂 15 g、甘草 6 g、澤瀉、白術、桂枝、姜黃、桃仁、川芎、決明子、荷葉各10 g組成(西安北京同仁堂大藥房)。水飛薊賓膠囊(國藥準字H20040299,天津天士力圣特制藥有限公司)。

1.2 動物模型的制備[12]用普通飼料適應性喂養大鼠1 w后,將60只大鼠隨機分為對照組12只和模型組48只。給予對照組動物普通飼料喂養,給予模型組高脂飼料喂養,在10 w末,在兩組各隨機處死3只大鼠,行血生化和肝組織病理學檢查,確認模型組大鼠血脂含量上升和病理學檢查提示30%以上的肝組織細胞內有大泡性或伴有小泡性脂肪變性,為造模成功。再將模型組動物隨機分為模型組、大、中、小劑量化濁通瘀湯組和水飛薊賓組,每組9只。此時6組動物均改喂普通飼料。

1.3 干預方法 用蒸餾水給對照組和模型組大鼠灌胃。浸泡、煎煮中藥各30 min,水煎2次,過濾、濃縮后,放在4℃環境下冷藏備用。在灌胃時,用蒸餾水稀釋。根據人與大鼠計量換算公式,大劑量組化濁通瘀湯為30 g.kg-1灌胃、中劑量組15g.kg-1、小劑量組7.5g.kg-1灌胃,水飛薊賓組為22 mg.kg-1灌胃,1次/d。8 w后,禁食半天,自由飲水,稱體質量。首先,用10%水合氯醛3 ml.kg-1腹腔注射麻醉,經腹主動脈采血8 ml,以3000 r/m離心10 min,分離血清。采集血液后,快速打開腹腔,取出肝臟,用生理鹽水洗凈,稱其濕質量,觀察形態并計算肝指數(肝濕質量/體質量×100%),取部分肝組織,浸入4%甲醛中固定備用,經脫水、石蠟包埋、切片、HE染色,在光鏡下觀察大鼠肝組織形態變化。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件行統計學處理,計量資料以(±s)表示,均數的比較采用t檢驗,多組間均數的比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 模型組大鼠肥胖,活動量減少,糞便增多且黏、臭,反應慢;在灌胃給藥8 w后,各干預組大鼠上述情況明顯好轉,其中大劑量化濁通瘀湯和水飛薊賓干預組大鼠活動量增多,反應較快。模型組大鼠在灌胃操作時,死亡1只。

2.2 各組大鼠體質量和肝指數比較 與模型組大鼠比,各干預組大鼠體質量明顯下降(P＜0.01);各干預組大鼠體質量差異無統計學意義(P＞0.05);6組大鼠肝指數變化差異無統計學意義(P＞0.05,表1)。

表1 各組大鼠體質量和肝指數(±s)比較

表1 各組大鼠體質量和肝指數(±s)比較

與模型組比,①P＜0.01

只數 體質量(g) 肝指數對照組 9 487±17.8 2.3±0.1大劑量中藥 9 566±19.4① 2.3±0.1中劑量中藥 9 577±24.3① 2.4±0.1小劑量中藥 9 585±18.5① 2.4±0.2水飛薊賓 9 568±22.7① 2.3±0.1模型組 8 624±13.4 2.4±0.3

2.3 各組大鼠血清ALT和AST水平比較 模型組大鼠血清ALT和AST水平顯著高于對照組(均P＜0.01);各干預組血清ALT和AST水平顯著低于模型組(均P＜0.01 或P＜0.05,表2)。

表2 各組大鼠血清AST和ALT水平(±s)比較

表2 各組大鼠血清AST和ALT水平(±s)比較

與模型組比,①P＜0.01

只數 ALT(U/L) AST(U/L)對照組 9 47.3±3.2 94.0±17.5大劑量中藥 9 51.3±2.2① 132.2±13.8①中劑量中藥 9 64.1±5.5① 152.0±10.8①小劑量中藥 9 71.7±2.2 168.6±6.0①水飛薊賓 9 55.9±2.9① 138.6±12.0①模型組 8 75.7±3.0 194.1±22.9

2.4 各組大鼠血TC、TG和FBG的比較 模型組血清TC、TG和 FBG水平顯著高于對照組(均P＜0.01);與模型組相比,干預組TC、TG和FBG水平下降顯著(均P＜0.01,表3)。

表3 各組大鼠TC、TG和FBG(±s)比較

表3 各組大鼠TC、TG和FBG(±s)比較

與模型組比,①P＜0.01

只數 TC(mmol/L) TG(mmol/L) FBG(mmol/L)對照組 9 1.1±0.1 0.2±0.1 5.2±0.1大劑量中藥 9 1.1±0.1① 0.3±0.0① 5.6±0.1①中劑量中藥 9 1.3±0.1① 0.3±0.1① 5.7±0.2小劑量中藥 9 1.5±0.1 0.3±0.1① 6.5±0.3水飛薊賓 9 1.2±0.1① 0.3±0.1① 5.5±0.1①模型組 8 1.7±0.1 0.5±0.1 6.1±0.3

2.5 各組大鼠肝組織病理學變化比較 對照組大鼠肝小葉環繞中央靜脈呈放射狀分布,肝竇正常,肝細胞索排列整齊,細胞核呈單核或者雙核居中央,胞質均勻豐富;模型組大鼠肝小葉周圍可見炎性細胞浸潤,肝竇變窄,肝細胞索排列無序,肝細胞體積增大,肝細胞內呈現脂滴空泡,細胞核被擠壓,甚至消失;小劑量化濁通瘀湯和水飛薊賓組肝小葉較模型組脂滴空泡減少;大、中劑量化濁通瘀湯處理組動物肝小葉結構可見,肝竇清晰,肝細胞索排列有序,部分肝細胞可見少許脂滴空泡,大部分肝細胞接近正常形態(圖1)。

圖1 肝組織病理學表現 (HE,100×)

2.6 各組大鼠血清TNF-α和瘦素(leptin)水平比較模型組大鼠血清TNF-α和leptin水平顯著高于對照組(P＜0.01);與模型組比,大、中劑量化濁通瘀湯處理組和水飛薊賓組血清TNF-α和leptin水平明顯降低(P＜0.01,表4)。

表4 各組大鼠血清TNF-α和瘦素(±s)比較

表4 各組大鼠血清TNF-α和瘦素(±s)比較

與模型組比,①P＜0.01

只數 TNF-α(pg/mL) 瘦素(ng/mL)對照組 9 23.6±2.2 1.7±0.1大劑量中藥 9 30.7±3.5① 2.8±0.2①中劑量中藥 9 34.1±4.2① 2.8±0.1①小劑量中藥 9 37.0±2.3① 3.2±0.2水飛薊賓 9 32.5±3.1① 2.9±0.1①模型組 8 44.3±3.9 3.3±0.3

3 討論

TNF-α來源于肝巨噬細胞的分泌,是導致NASH的主要因子,可通過激活神經鞘磷脂酸來抑制細胞線粒體呼吸鏈的電子傳遞過程,使得線粒體內的活性氧生產增多,增強氧化應激反應,誘發并加重IR,促使肝臟炎癥發生,導致細胞壞死[13-15]。瘦素又名脂肪抑制素,是一種脂肪細胞分泌的多肽激素,能夠阻止游離脂肪酸對非脂肪組織的侵入和積聚。瘦素與胰島素間具有相互調節作用,高水平瘦素引起胰島素血癥、IR,瘦素能夠誘導肝星狀細胞(HSC)增殖和活化,是肝纖維化的啟動因子之一[16,17]。

NAFLD的病因主要有飲食不節制或喜食肥甘厚味、勞逸過度、情志失調、高齡以及環境等影響,有著明顯的家族聚集現象。NAFLD屬于中醫“痰濁”、“血瘀”、“積聚”、“脅痛”范疇,主要由于飲食偏好與過度,損傷脾胃,脾胃為后天之本,主受納運化,脾失健運,則水濕內停,濁邪內生,加之肝氣不暢,久則瘀化熱,且肥人多氣虛懶動,氣血運行受阻,久坐成瘀,終成濁瘀。濁瘀屬陰,陰盛則陽虛,干預宜溫陽化濁,行氣化瘀。方以化濁通瘀湯,方中桂枝溫陽化氣,白術健脾燥濕,茯苓,澤瀉健脾滲濕,丹參、姜黃、桃仁、川芎活血化瘀、荷葉醒脾,山楂消食化瘀,甘草調和諸藥。化濁通瘀湯方系苓桂術甘湯加減,最近研究表明,苓桂術甘湯可抑制代謝綜合征大鼠血清TNF-α、瘦素水平升高,緩解高脂血癥、肥胖、肝損傷、高血糖,荷葉、山楂、澤瀉能降低血壓和膽固醇,川芎、丹參、桃仁具有改善肝功能、降酶、降濁等作用[18,19]。水飛薊賓能夠穩定肝細胞膜,保護其酶系統,清除肝細胞內的活性氧自由,使肝臟解毒能力提高,抗脂質過氧化、降血脂、抗炎、調節免疫[20-22]。

化濁通瘀湯通過降低TNF-α和Leptin表達,從而減輕氧應激和細胞因子等相關性損害,改善NAFLD大鼠生化指標,減輕肝臟炎癥,改善葡萄糖代謝,實現防治NAFLD的目的。綜上所述,本研究為臨床干預NAFLD提供了理論依據。