內蒙古烏海地區沙漠葡萄發酵醪液中釀酒酵母菌的篩選與鑒定

趙雪平，溫雅嬌，李正英，*，鄭海武，黃海英，李曉娟

（1.內蒙古農業大學職業技術學院，內蒙古包頭014109；2.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018）

釀酒酵母的分布與地理位置和氣候條件有關，目前世界大部分產區的釀酒酵母被廣泛研究[1-4]，我國葡萄產區的釀酒酵母也被廣泛關注，主要集中在寧夏、新疆、云南、山東等地。趙悅等對云南葡萄產區的釀酒酵母多樣性進行了研究[5]，馬文瑞等在新疆產區篩選了高產酸釀酒酵母[6]，趙曉寧等對河北產區的釀酒酵母菌進行了分析和鑒定[7]，張春芝等對寧夏產區的釀酒酵母菌進行了鑒定[8]，而內蒙古地區的釀酒酵母的篩選和分離，尚有大量的工作去做，內蒙古烏海市位于北緯 39°02′～39°54′，東經 106°36′～107°08′地處黃河上游，東臨鄂爾多斯高原，庫布奇沙漠、毛烏素沙漠和烏蘭布和沙漠，三大沙漠環繞烏海，光照充足，晝夜溫差大，為葡萄生長提供了很好的地理和環境條件，所產的葡萄的糖度大，故為酵母菌提供了良好的生長繁殖場所，因此期許在此地區能夠篩選出優良的釀酒酵母菌。酵母菌在葡萄酒發酵過程中扮演著重要的角色，它分解葡萄汁中的大部分糖并轉化為酒精和二氧化碳。但還會生成一些其他的代謝產物，包括甘油、高級醇、酯、醛等，而這些影響了葡萄酒的色澤、香氣及口感，這些因素直接決定著葡萄酒的質量[9]。優良釀酒酵母菌的篩選不僅要考察釀酒酵母菌的發酵能力、耐受性，更重要的是產品的品質。因此酵母菌的篩選對于葡萄酒品質的提升具有很重要的意義。

本研究以內蒙古烏海地區農家自釀發酵醪液為篩選來源，對照商業菌株，通過發酵能力、耐受性、產酒精能力、低產硫化氫、產酯能力，分3 級進行篩選，并且進行鑒定及產品感官評價。以期為我國葡萄酒的發展提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌種

測試菌種：采集于內蒙古自治區烏海農家自釀發酵醪液。

對照菌種：葡萄酒活性干酵母（編號CECA）：安琪酵母股份有限公司；釀酒酵母（編號CSM）：法國拉曼公司。

1.1.2 原料

釀酒葡萄采于內蒙古農業大學職業技術學院科技園區。

1.1.3 培養基

孟加拉紅瓊脂培養基：孟加拉紅0.033 g/L，氯霉素0.1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂15 g/L；

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）固體培養基：酵母浸出粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂 14 g/L，葡萄糖 20 g/L。

酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液體培養基：酵母浸出粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。

氯化三苯基四氮唑（2，3，5，-triphenyltetrazolium，TTC）上層培養基[10]：TTC 0.5 g/L，葡萄糖 5 g/L，瓊脂15 g/L。

TTC 下層培養基[10]：硫酸鎂0.4 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，酵母浸出粉1.5 g/L，蛋白胨2 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂20 g/L，調節pH 值至5.5。

BIGGY 瓊脂培養基：BIGGY 瓊脂 45 g/L。

產酯固體培養基[11-12]：溴甲酚紫0.04 g/L，三丁酸甘油脂15 mL/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂 20 g/L。

發酵培養基：硫酸銨1 g/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，酵母浸粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖200 g/L。

1.1.4 主要試劑

酵母浸粉、胰蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖：天津市風船化學試劑科技有限公司；瓊酯粉：天津市科密歐化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀：天津市標準科技有限公司；硫酸銨：天津市天大化學試劑廠；硫酸鎂：北京雙環化學試劑廠；氫氧化鈉：天津市盛奧化學試劑有限公司；乳酸：天津市化學試劑三廠；乳酸鉀：山東優索化工科技有限公司；酒石酸鉀鈉：國藥集團化學試劑有限公司；酵母菌DNA 提取試劑盒：天根生化科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.1.5 儀器與設備

全功能酶標儀（synergyHIMF+Take3）：美國BioTek儀器有限公司；電子天平（TP-214）、酸度計（PHS-3C）、移液器（1 00 μL～1 000 μL）：丹佛儀器北京有限公司；可調式封閉電爐（FL-2）：天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫震蕩培養箱（THZ-98AB）、生化培養箱（LRH-70）、光學顯微鏡（CX21）、電熱恒溫水浴鍋（HWS12）：上海一恒科學儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（SX-700）：北京世貿遠東科學儀器有限公司；超凈工作臺（VD-1320）：哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；高速離心機（HC-2518R）：海玉博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母菌株的分離純化

以內蒙古烏海地區農家自釀發酵醪液為酵母菌的收集來源。將收集的樣品制成菌液，并且稀釋，吸取50 μL 稀釋后的菌液于孟加拉紅固體平板上，用涂布棒涂勻，28 ℃培養1 d～3 d。挑選單個的具有典型酵母菌菌落特征且形態差異較為明顯的菌落，劃線純化兩到三代，將上述分離純化得到的酵母菌接入YEPD 斜面培養基，4 ℃保藏。

1.2.2 釀酒酵母菌株一級篩選

采用酵母菌株發酵力試驗進行一級篩選。將分離純化得到的酵母菌株活化，接入放有倒置杜氏管的YPD 液體培養基試管中，28 ℃培養，每隔12 h 觀察其產氣情況，記錄杜氏管內氣體體積[10]。去除發酵速度慢，不產氣的菌株。將起酵速度快，產氣多的菌株篩選出來，并用于二級篩選。

1.2.3 釀酒酵母菌株二級篩選

采用耐受性測定進行二級篩選，包括耐酒精性能試驗、耐SO2性能試驗、高糖耐受性試驗和低pH 值的耐受性試驗，將YPD 液體培養基分裝到試管中再放入倒置的杜氏管，杜氏管內不含空氣。121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫（25 ℃），按照表1 調節培養基條件梯度，酒精度和SO2濃度先滅菌后調整，糖度和pH 值先調整后滅菌。接種待測酵母菌株接2%，每個處理平行3 次，28 ℃培養1 d～3 d，觀察其產氣狀況判斷其耐受性。以商業釀酒酵母CECA 和CSM 及空白試驗作為對照。酵母菌株耐受性測定條件梯度設置見表1。

表1 酵母菌株耐受性測定條件梯度Table 1 Conditional gradient for tolerance measurement of yeast strains

1.2.4 釀酒酵母菌株三級篩選

將分離后的酵母菌株利用TTC 培養基顯色法測定菌株產酒精能力，BIGGY 瓊脂培養基顯色法測定菌株產硫化氫性以及產酯培養基顯色法測定菌株產酯特性。篩選出產酒精能力強、低產硫化氫且高產酯的優良酵母菌株。

1.2.4.1 高產酒精酵母菌株的篩選

酵母菌株劃線接種到TTC 下層培養基上，以商業釀酒酵母CECA 和CSM 及空白試驗作為對照，28 ℃培養1 d～3 d 后，在菌落上覆蓋一層TTC 上層培養基，28 ℃遮光培養。觀察各平皿中菌落的顯色情況，菌株與培養基反應，使菌落呈現白色、淺紅色、紅色和深紅色，菌落呈現的顏色越深，表明菌株產酒精能力越強。

1.2.4.2 低產硫化氫酵母菌株的篩選

將1.2.4.1 中篩選出的高產酒精酵母菌株點種到BIGGY 瓊酯培養基上，并以商業釀酒酵母CECA 和CSM 及空白試驗作為對照，28 ℃培養1 d～3 d，觀察各菌株菌落顏色，菌株產生的硫化氫與BIGGY 培養基中的鉍發生反應，使菌落呈現白色、黃色、淺棕色和深棕色，顏色越深，代表菌株產硫化氫的量越多。

1.2.4.3 高產酯酵母菌株的篩選

將1.2.4.2 中篩選出的酵母菌株劃線接種到產酯培養基上，以商業釀酒酵母CECA 和CSM 及空白試驗作為對照。觀察其菌落顏色。菌株產酯能力不同所呈現在產酯平板上的菌落顏色也不相同，菌落黃色越濃，表明菌株的產酯量越多[13]。

1.2.5 優良菌株的分子生物學鑒定

酵母菌株KT3 送至生工生物工程（上海）股份有限公司，進行26S rDNA D1/D2 區測序[14-16]，酵母菌株序列測定后，將測序結果在NCBI 數據庫中進行比對，通過比對測序菌株與數據庫中模式菌株的可信值進行鑒定，用Mega 軟件構建系統進化樹。

1.2.6 優良酵母菌發酵特性的測定

將優良酵母菌株按2%的接種量接入到發酵培養基中，每組試驗3 個平行，并以商業釀酒酵母CECA 和CSM 及空白試驗作為對照。在130 r/min，28 ℃恒溫振蕩培養，每隔12 h 稱重并記錄。計算出菌株的CO2失重量，判斷菌株的發酵速率。

將優良菌株接種到YPD 液體培養基中，28 ℃培養。每隔2 h 測定菌液的OD600值，連測16 次，根據OD值繪制其生長曲線，確定其生長對數期。

1.2.7 酵母菌株發酵產品感官評價

將培養至對數生長期的優良菌株接種到YPD 液體培養基中，在10 ℃、12 000 r/min 條件下離心3 min，收集菌泥備用[17]。選用種植于內蒙古農業大學職業技術學院科技園區的葡萄進行發酵試驗[葡萄汁理化指標為：23.0 Brix°，還原糖 154.07 g/L，總酸（6.86±0.2）g/L，pH 值3.14]。葡萄汁中按2%的接種量接入優良酵母菌株，同時用法國商業酵母CSM 和國產商業酵母CECA 作對照。在25 ℃下恒溫發酵。每24h 測定還原糖、總酸和酒精度，當殘糖含量下降至4 g/L 以下時視為發酵結束[18-19]，按照 GB/T 15037-2006《葡萄酒》[18]的方法，組織7 位有經驗的品評員，進行感官評定。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母菌的分離純化

將發酵醪液中酵母菌的分離純化，通過對酵母菌形態觀察以及顯微鏡鏡檢，初步去除重復菌株，共篩選 出 22 株 酵 母 菌 株 編 號 為 ：KC1 ～KC4、KS1 ～KS3、KP1～KP6、KJ1～KJ3、KT1～KT3、KZ1～KZ3。

2.2 釀酒酵母菌的篩選

2.2.1 釀酒酵母菌的一級篩選

將分離純化的22 株酵母菌進行酵母菌發酵能力測定，測定結果見表2。

表2 酵母菌株發酵力測定結果Table 2 Determination of fermentation ability of yeast strains

由表2 可知，分離純化的22 株酵母菌株經過杜氏管產氣試驗，有10 株菌能在12 h 內（包括12 h）發酵產生CO2，并充滿杜氏管，說明這部分菌株的發酵能力最強，活力最旺盛；有9 株酵母菌能在24 h 內（包括24 h）起酵并產氣充滿杜氏管，說明這些菌株的生長速度較快，能夠在短時間內開始發酵；有3 株酵母菌未在48 h 內產氣，說明其生長繁殖慢，發酵力弱。葡萄酒的生產釀造中，葡萄原汁并不經過消毒殺菌，若持續48 h都無法開始發酵，就會導致葡萄汁變質，影響口感和酒的品質，所以將未在48 h 內產氣的菌株淘汰，僅保留余下的19 株菌進行二級篩選試驗。

2.2.2 釀酒酵母菌耐受性測定

將一級篩選得到得19 株菌進行耐受性測定，結果見表3。

國標GB 2760-2011《食品添加劑使用標準》[20]要求葡萄酒生產中SO2最大添加量不超過250 mg/L，釀制干紅葡萄酒的葡萄含糖量一般大于20%壓榨后的冰葡萄汁含糖量能達到35%～45%[21]，新鮮葡萄汁的pH 值范圍在3～4.5 之間，本研究中的19 株酵母菌均符合釀酒酵母耐受性的要求。

表3 酵母菌株耐受性能測定試驗結果Table 3 Screening results of ester-producing characteristics

2.2.3 高產酒精酵母菌的篩選

將分離純化的19 株酵母菌進行產酒精能力試驗，結果見表4。

表4 酵母菌在TTC 培養基上的顯色結果Table 4 Chromogenic results of yeast on TTC medium

由表4 可知，有 8 株酵母菌（KT2、KT3、KS3、KP4、KP6、KJ2、KZ1、KZ3） 的菌落在 TTC 培養基上呈深紅色，其產酒精能力與對照組相當，因此選擇這8 株產酒精能力強的酵母菌進行下一步的篩選試驗。

2.2.4 低產硫化氫酵母菌株的篩選試驗

將高產酒精的8 株酵母菌進行低產硫化氫酵母菌株的篩選試驗，結果見表5。

表5 酵母菌在BIGGY 培養基上菌落顏色Table 5 Colony colour of yeast on BIGGY medium

BIGGY 瓊脂是一種具有選擇性的培養基，使用鉍作為指示劑，來測定菌株生長時是否有產生硫化氫，顏色越深，表面菌株產硫化氫越多[22]。由表5 可知，對照菌株CECA 菌落在BIGGY 培養基上呈淺棕褐色，為低產硫化氫酵母，CSM 呈棕褐色，為中產硫化氫酵母。硫化氫產生的不良氣味會影響葡萄酒的風味[23]，且對人體有毒害作用，基于此，僅保留低產和中產硫化氫的菌株KP3、KJ2 和KT3 作后續研究。

2.2.5 高產酯酵母菌株的篩選試驗結果

將3 株低中產硫化氫高產酒精酵母分別接種到產酯培養基上，并以商業菌株CECA 和CSM 作對照，28 ℃恒溫培養1 d～3 d。觀察菌落附近的顏色并記錄，顯色結果見表6。

由表6 可知，對照菌株CECA、CSM 及KT3 的菌落在產酯培養基上呈深黃色，即產酯能力較強，選擇KT3 酵母菌株進行后續研究。

2.3 優良酵母菌的鑒定

酵母菌株KT3 的聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）擴增電泳圖如圖1。

表6 產酯特性篩選結果Table 6 Screening results of ester-producing characteristics

圖1 酵母菌株PCR 擴增電泳圖Fig.1 PCR amplified electrophoresis map of yeast strains

如圖1 所示，通過對酵母菌株DNA 的提取和PCR擴增，可以看出酵母菌株的DNA 片段長度在580 bp～600 bp 左右，符合前人對酵母菌基因序列長度的研究范圍[24]。

DNA 測序結果在NCBI 網站上進行序列同源性比對，結果見表7。

通過比較得到酵母菌株KT3 的DNA 片段與釀酒酵母同源性最高，達到99%，與測序結果進行對比，并用MEGA6.0 構建系統進化樹，見圖2。最終確定酵母菌株KT3 為釀酒酵母。

表7 酵母菌株26S rDNA D1/D2 序列測序結果Table 7 Sequencing results of 26S rDNA D1/D2 sequence of yeast strain

2.4 優良酵母菌發酵特性測定

釀酒酵母菌株KT3 生長曲線如圖3 所示。

圖3 可以看出，在2 h～4 h 內，菌株處于調整期，菌株繁殖較慢；4 h～12 h，菌株進入對數生長期；培養到12 h～30 h 時，菌株進入穩定期；在 30 h～36 h 時，菌株活力下降逐漸進入衰亡期。綜上可知該釀酒酵母菌具有良好的生長特性。

酵母菌株KT3 的發酵速率測定結果見圖4。

由圖4 可知，菌株KT3 的發酵液CO2失重略小于對照菌株CECA 發酵液的CO2失重，大于對照菌株CSM 發酵液CO2失重，具有良好的發酵速率。

2.5 酵母菌株發酵產品感官評價

優選的釀酒酵母和2 株商業釀酒酵母發酵的葡萄酒的色澤、香氣、澄清度、滋味、典型性等方面進行評分[25-26]，結果見表8 和圖5。

圖2 酵母菌株26S rDNA 構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by yeast strain 26S rDNA

圖3 KT3 生長曲線圖Fig.3 OD600 value of growth curve of KT3

圖4 CO2 失重Fig.4 CO2 weight loss

表8 不同酵母菌發酵的干紅葡萄酒感官評分表Table 8 Sensory scoring scale for dry red wine fermented by different yeasts

圖5 不同酵母菌發酵的干紅葡萄酒感官評定Fig.5 Sensory scoring scale for dry red wine fermented by different yeasts

在2 株商業酵母菌和1 株優選酵母菌發酵葡萄酒的感官評分中，評分從高到低依次為CECA、KT3、CSM。篩選出的優良菌株中KT3 釀制的葡萄酒酒體澄清透亮有光澤，呈寶石紅色，入口偏酸，口味獨特，層次豐富，有典型性。

3 結論

本文以內蒙古烏海地區自然發酵醪液為篩選來源，通過篩選得到1 株酵母菌KT3，經26S rDNA D1/D2 區域測序，確定KT3 為釀酒酵母菌，該酵母菌的耐酒精度為16%，耐SO2濃度為450 mg/L，耐高糖濃度為50%，耐pH 值為2.5，具有良好的耐受性，產品典型性突出，可以用于商業化生產。