Cdc42調控細胞骨架影響破骨細胞分化的研究

宋瑞龍，徐天祺,梁琰,曹瑩,劉宗平

(揚州大學獸醫學院/江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州，225009)

骨是一種動態組織，骨重建過程分為成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收，其動態平衡有利于維持機體內正常的骨代謝和血鈣水平[1]。破骨細胞具有獨特的骨吸收活性，其主要來源于單核巨噬細胞。破骨細胞對骨骼生長、發育、修復與重建起著至關重要的作用。破骨細胞的異常與動物機體骨質疏松、骨腫瘤等多種骨科疾病密切相關[2]。

細胞骨架的動態聚合積極參與破骨細胞前體細胞的遷移、識別與融合，在破骨細胞分化的過程中扮演著重要的角色。細胞骨架是細胞偽足的重要成分，細胞偽足可分為板狀偽足與絲狀偽足，其形成主要依賴于肌動蛋白的聚合。因此，肌動蛋白的異常會直接導致細胞骨架重塑的紊亂，影響細胞遷移和信號轉導等生理功能，最終導致破骨細胞分化異常[3-4]。相反，對肌動蛋白的調節可成為調控破骨細胞分化的潛在靶點，Rho家族蛋白被證明是肌動蛋白的關鍵調節蛋白，Rho與鳥嘌呤三核苷酸(GTP)結合活化后，對細胞外信號進行整合以介導細胞形狀學變化，調節細胞形態與功能[5-6]。作為Rho家族的重要成員，Cdc42活化后可通過對微絲的調節參與細胞骨架的重塑、細胞極性的調節和細胞遷移等過程[5,7]。然而，目前對Cdc42影響破骨細胞分化的作用機理尚未明確。

巨噬細胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)和核因子κB受體激動劑配體(ligand of receptor activator of NF-κB, RANKL)是誘導破骨細胞的分化成熟的主要因子[8-9]。本研究擬構建Cdc42基因沉默的RAW264.7細胞，并加入M-CSF和RANKL予以誘導分化，觀察細胞骨架蛋白相關基因以及破骨細胞標志性基因的表達水平的變化，旨在闡述Cdc42表達對破骨細胞分化的影響，探討該作用產生的作用機制，為畜牧養殖中骨科疾病的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞

小鼠RAW264.7細胞系源自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.2 主要試劑

Cdc42干擾慢病毒顆粒(賽業生物)；TRAP染色試劑盒(Sigma)；DMEM,α-MEM(Gibco)；胎牛血清(FBS)(GEMINI)；反轉錄試劑盒(TaKaRa)；RANKL和M-CSF(Peprotech)；DAPI染液(碧云天生物)；Trizol(Invitrogen)；熒光定量試劑盒(TaKaRa)；鬼筆環肽、Rat mAb to Tubulin和Goat pAb to Rat IgG H&L (Alexa Fluor? 488)(Abcam)；RIPA裂解液(普利萊生物)；兔抗GAPDH、Cdc42、Cofilin(Abcam)；兔抗PAK4(Biodragon)。

1.3 Cdc42沉默穩轉株的建立

將RAW264.7細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養液中懸浮后，以5×104/孔接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，12 h后添加4.3×107TU Cdc42慢病毒顆粒，同時添加終濃度為5 μg/mL的Polybrene。病毒轉染后12 h更換細胞培養液，繼續培養3 d，待細胞密度達到70%時加入含有終濃度為4 μg/mL的嘌呤霉素的基礎培養液選擇性培養3 d，擴增能夠穩定生長的細胞，凍存保種用于后續試驗。

1.4 沉默效率的檢測

采用Trizol裂解法提取Cdc42沉默組與對照組細胞的總RNA，并檢測其完整性和純度。按逆轉錄試劑盒說明書，于37 ℃反應15 min，85 ℃滅活5 s，獲得的cDNA。取定量cDNA配制成20 μL的熒光定量反應體系，于熒光定量PCR儀中測定其擴增及溶解曲線，熒光定量PCR擴增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s；60 ℃ 31 s；溶解曲線條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。利用2-△△CT的方法，分析不同組之間Cdc42基因的相對轉錄水平。

1.5 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色

Cdc42沉默組及對照組細胞按8×103/mL懸浮于含50 ng/mL M-CSF、60 ng/mL RANKL、10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養液，接種于六孔板，每孔接種2 mL，第3天換液，第4天棄去培養液。參照TRAP染色試劑盒說明書進行染色，于100倍倒置顯微鏡下觀察破骨細胞的細胞形態與偽足的變化。

1.6 免疫熒光染色

Cdc42沉默以及對照組細胞按3.2×103/mL懸浮于含50 ng/mL M-CSF、60 ng/mL RANKL、10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養液，接種于放置有爬片的24孔板中，每孔接種1 mL，第3天更換同種培養液，第4天取出爬片，以PBS清洗2-3次，4%的PFA固定，37 ℃ 20 min，PBS沖洗3次，加入抗F-肌動蛋白(F-action)與微管蛋白(tubulin)的抗體，冰盒中孵育過夜。12 h后以PBS沖洗6次, 每次5 min，避光孵育熒光二抗2 h，PBS沖洗6次，每次5 min，DAPI 孵育15 min，PBS沖洗同上，50%甘油封片, 激光共聚焦顯微鏡下觀察Cdc42沉默對細胞骨架和偽足的影響。

1.7 實時熒光定量PCR

采用1.4中的方法分別提取誘導4 d后細胞的總RNA，將其逆轉錄成cDNA，通過熒光定量PCR儀以GAPDH為內參基因，利用SYBR Green染料法分別對TRAP、RAK4、Cofilin的相對表達含量進行測定，并比較Cdc42沉默組與對照組之間上述基因的轉錄水平。引物見表1。

表1 qRT-PCR的引物及序列

基因基因號正向引物反向引物GAPDHGU214026ATGGTGAAGGTCGGTGTGTGAAGGGGTCGTTGATGGCdc42NM_009861CCTTTCTTGCTTGTTGGGACTGCGGCTCTTCTTCGGTTTRAPNM_001102405GGCTACTTGCGGTTTCACTATTCCTTGGGAGGCTGGTCTPAK4NM_027470.3ATCAGCACGCAGACCCAACATGTTCTCAAATTCGTCAAGCCofilinD00472.1ATGTGGGGCAGACTGTGGATTGGAAACTCACACGCCAGAAG

1.8 Western blot檢測

棄去細胞培養基，PBS清洗3次，加入RIPA裂解液，用細胞刮刀將細胞刮下，置于冰上裂解20 min，取裂解液，超聲裂解40 s， 4 ℃ 12 000 g離心10 min，取上清。采用BCA法測蛋白濃度，調整蛋白濃度使各組濃度一致。加入4×SDS loading buffer，隔水煮沸5 min。目的蛋白每孔上樣20 uL，以10% SDS-PAGE分離，并轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入GAPDH、Cdc42、Cofilin、PAK4一抗，4 ℃孵育過夜。用TBST清洗3次，每次5 min，室溫孵育二抗2 h，TBST清洗后顯影。GAPDH作為內參，采用Image Lab軟件計算灰度值。

1.9 統計學分析

應用SPSS24.0軟件對數據進行統計學分析，以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。利用 GraphPadPrism5軟件繪制柱形圖。

2 結果

2.1 Cdc42慢病毒沉默效果

嘌呤霉素篩選后的轉染細胞形態穩定，細胞生長速度較好。Cdc42 mRNA表達水平極顯著降低，與對照組相比差異極顯著；Western blot檢測顯示Cdc42蛋白表達量顯著下降，見圖1。結果說明細胞生長繁殖能力優良，生長穩定，該Cdc42慢病毒轉染篩選后形成的穩轉株穩定，干擾效率高，可用于后續試驗。

A為基因相對轉錄水平，B為蛋白相對表達量，*表示P<0.05，**表示P<0.01，下同

圖1 慢病毒轉染后Cdc42沉默效率檢測

2.2 Cdc42沉默對破骨細胞分化的影響

細胞誘導4d后的TRAP染色結果(見圖2)顯示Cdc42沉默組未發現TRAP陽性細胞，相反，對照組可觀察到大量的TRAP陽性細胞，說明M-CSF和RANKL成功誘導對照組RAW264.7細胞分化為破骨細胞，而Cdc42基因的沉默抑制了破骨細胞的分化。

2.3 Cdc42沉默對前體細胞偽足和骨架的影響

激光共聚焦顯微鏡結果顯示，Cdc42沉默組的細胞呈圓形，較為規則，基本無絲狀偽足和板狀偽足，而對照組可觀察到大量的絲狀偽足(見圖3)，基本具有對稱分布的板狀偽足。說明Cdc42的表達沉默可引起細胞骨架形態結構的異常，影響細胞板狀偽足和絲狀偽足的形成。

2.4 Cdc42沉默對破骨細胞標志性基因轉錄水平的影響

分別提取誘導4 d后的對照組和Cdc42沉默組細胞的總mRNA，熒光定量PCR技術檢測破骨細胞分化相關基因mRNA轉錄水平，結果如圖4所示，與對照組比較，Cdc42沉默組TRAP、PAK4與Cofilin的轉錄水平極顯著下調。

A. 對照組;B. Cdc42沉默細胞株

圖2 Cdc42基因沉默對破骨細胞分化的影響(100×)(箭頭所指為破骨細胞)

A. 激光共聚集顯微鏡觀察；B. 絲狀偽足數量；C. 板狀偽足數量

圖3 Cdc42基因沉默對微管和微絲的影響(箭頭所指為絲狀偽足，三角標注為板狀偽足)

圖4 Cdc42對破骨細胞TRAP(A)，PAK4(B)和Cofilin(C)轉錄水平的影響

2.5 Cdc42沉默對破骨細胞標志性蛋白表達水平的影響

分別提取對照組和Cdc42沉默組細胞的總蛋白，Western blot檢測破骨細胞分化相關蛋白Cofilin和PAK4的表達水平，結果如圖5所示，與對照組相比，Cdc42沉默組PAK4與Cofilin的蛋白表達水平分別顯著和極顯著下降。

A. Western blot分析；B. Cofilin表達；C. PAK4表達

圖5 Cdc42對破骨細胞PAK4和Cofilin蛋白表達的影響

3 討論

破骨細胞是由造血干細胞融合分化而來，是維持機體骨重建的關鍵所在。破骨細胞在M-CSF 和RANKL的共同作用下存活、分化與活化，發揮骨吸收的作用[10-11]。對破骨細胞形成、分化和骨吸收機理的研究，有助于防治畜牧養殖過程中所發生的骨質疏松等多種骨科疾病，可有效提高動物的經濟價值。

Cdc42是Rho家族的重要成員之一，具有GTP酶活性，在調節細胞骨架相關蛋白的聚合與解聚中起到重要的作用[5,7]。研究表明Cdc42可以通過調節細胞與基質的黏附以及細胞骨架形成和重組，參與細胞的遷移、增殖、分化和凋亡[12-13]。為探討Cdc42對破骨細胞分化、成熟的影響，本研究首先利用慢病毒技術干擾RAW264.7細胞中Cdc42的表達，同時我們采用嘌呤霉素對慢病毒轉染的細胞進行篩選，獲取生長狀態和細胞形態良好的細胞。對所獲的細胞用qRT-PCR與Western blot予以鑒定，明確了Cdc42基因在病毒轉染組的表達顯著或極顯著低于對照組中的表達水平，證明Cdc42沉默穩轉株已構建成功。

TRAP是破骨細胞功能活性和成熟的重要標志物，是破骨細胞在骨吸收過程中高度表達的特征性酶[14]。我們利用TRAP染色觀察Cdc42基因沉默對RAW264.7細胞分化為破骨細胞的影響，結果發現Cdc42沉默組細胞誘導分化后，未見TRAP陽性染色的破骨細胞，且TRAP的mRNA表達水平較對照組極顯著降低。結合F-action和tubulin的免疫熒光染色，我們發現Cdc42的表達異常極大地抑制了肌動蛋白的聚合作用，導致細胞前緣突起障礙，絲狀偽足與板狀偽足數量減少。這些結果說明，Cdc42的缺失阻礙了細胞遷移與融合，最終導致破骨細胞分化過程受阻和發育不成熟。我們的發現與之前Melendez等[14]所報道的類似，他們提出Cdc42可通過調節相關骨架蛋白的聚合與解聚以參與腫瘤細胞的的運動遷移與融合。

此外，我們還發現Cdc42基因沉默可引起破骨細胞中PAK4與Cofilin基因轉錄與蛋白表達水平的下調，可能與Cdc42下游信號通路傳導中斷有關，有研究顯示Cdc42可激活下游PAK、WASP和ACK等信號傳導[15-17]。PAKs是一種與人類腫瘤相關的絲氨酸/蘇氨酸(Serine/Threonine，Ser/Thr)激酶，在腫瘤血管生成和細胞骨架重構等多過程中有重要作用；PAKs家族成員依據其分子結構和功能的不同將其分為2 個亞組：PAK1-3的Ⅰ組與PAK4-6的Ⅱ組[18]。PAK活化則通過LIM激酶1(LIMK1)的磷酸化促進外周肌動蛋白的重組，維持肌動蛋白的穩定性，進而調節細胞的形態與運動[19]。同時，PAK還可通過其下游信號影響Cofilin的活性與肌動蛋白絲的穩定性。另有研究表明，Cdc42的活化會引起Rac的局部活化， 活化的Rac可使RhoA被激活。目前對于Cdc42對細胞骨架的影響已經提出了兩種機制，包括它們對肌動蛋白細胞骨架和整聯蛋白粘附復合物的作用以及它們對基因轉錄的直接作用等[20]。在破骨細胞分化形成過程中，Cdc42的沉默極顯著下調了PAK4和cofilin的轉錄水平，說明Cdc42能夠通過兩者調控前體細胞的細胞骨架和偽足，進而影響破骨細胞的分化和形成。

綜上所述，Cdc42在破骨細胞分化成熟過程中起著至關重要的作用，其能經細胞骨架調控細胞偽足的形成，最終影響破骨細胞的分化。