綿羊血液中布氏桿菌DNA提取方法的比較研究

丁可莉，楊發(fā)龍，張煥容，郭莉，陽(yáng)愛國(guó)，莫茜，袁東波，侯巍*

(1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 611130；2. 四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 611130)

布氏桿菌病(Brucellosis)是由布氏桿菌(Brucella)引起的重要人獸共患傳染病。雖然很多發(fā)達(dá)國(guó)家已成功清除該病，但在一些發(fā)展中國(guó)家，人布氏桿菌病每年的發(fā)病率達(dá)千萬分之三，而在一些流行地區(qū)，可高達(dá)千分之一以上[1]，全球每年有近50萬人布氏桿菌病新增病例[2]。我國(guó)自2000年以來布氏桿菌病的發(fā)病率不斷上升，雖然從2016年開始其發(fā)病率有所回落，但仍處于高位，成為重要的公共衛(wèi)生問題[3]。

人布氏桿菌病均是直接或間接經(jīng)動(dòng)物傳染。其中，受感染的綿羊是農(nóng)牧區(qū)人感染布氏桿菌最主要的傳染源之一。獸醫(yī)、屠宰工人以及農(nóng)牧民等直接接觸感染綿羊胎兒、胎水、臟器、血液及分泌物等而感染，普通人群也可因消費(fèi)羊肉制品或生乳制品而感染。因此，控制和清除綿羊布氏桿菌病，對(duì)于控制人布氏桿菌病具有重要的意義。

傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定是布氏桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而其不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員造成嚴(yán)重的生物安全威脅，不可能作為常規(guī)診斷手段。PCR可以從各種臨床樣本中直接檢測(cè)布氏桿菌核酸，無需進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定，大大降低了生物安全問題，是一種快速、高度敏感及特異的病原學(xué)診斷技術(shù)。國(guó)內(nèi)外已建立了多種針對(duì)不同靶基因的布氏桿菌特異性PCR方法[4]。

PCR實(shí)現(xiàn)其敏感檢測(cè)的前提是要從樣本中獲得良好的病原DNA。然而，在很多情況下，由于在樣本中存在一些影響DNA提取的物質(zhì)以及抑制PCR擴(kuò)增的因子，導(dǎo)致其敏感性大大下降，例如血清蛋白、體細(xì)胞成份、多糖以及組織和體液的其他成份[5]。因此，在利用PCR對(duì)不同樣本中的布氏桿菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，篩選和優(yōu)化DNA提取方法，是實(shí)現(xiàn)后續(xù)PCR敏感和準(zhǔn)確檢測(cè)的重要前提[6-8]。

本研究對(duì)不同方法提取綿羊血液中布氏桿菌基因組DNA的效果，特別是對(duì)后續(xù)PCR檢測(cè)的影響進(jìn)行了比較，從而為今后利用PCR等分子檢測(cè)手段對(duì)綿羊血液中的布氏桿菌的檢測(cè)提供方法學(xué)上的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

布氏桿菌病活疫苗(S2株)為天康生物股份有限公司產(chǎn)品，每頭份含活菌數(shù)為1.0×1010CFU，80頭份/瓶。

1.2 主要試劑

DNeasy Blood & Tissue Kit為QIAGEN公司產(chǎn)品；TIANmp Blood DNA Kit為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit為AXYGEN公司產(chǎn)品；乙酸鈉、碘化鈉為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。蛋白酶K、飽和酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、SDS、EDTA均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；PremixTaq、DL2000 DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 含不同濃度布氏桿菌血液樣本的制備

將布氏桿菌活疫苗用8 mL無菌生理鹽水重懸，隨后采用生理鹽水，進(jìn)行10倍系列稀釋。從3只健康綿羊(布氏桿菌抗體檢測(cè)為陰性)采集抗凝血，分別進(jìn)行以下處理：為盡量不改變血液組分，取 0.1 mL上述不同濃度的菌液，分別加至9.9 mL綿羊抗凝血中，最終制備每1 mL血液含有1×106～1CFU布氏桿菌的綿羊血液樣本。另將0.1 mL生理鹽水加入9.9 mL綿羊全血中，作為陰性對(duì)照。

1.4 總DNA提取

分別采用DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN)、TIANmp Blood DNA Kit (天根)、AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit(AXYGEN)以及酚/氯仿法和碘化鈉法，從上述含有不同濃度布氏桿菌的綿羊全血中提取總DNA。各方法主要過程如下。

酚/氯仿法[9]：吸取200 μL抗凝血，加入 500 μL STE、20 μL 10% SDS、20 μL 10 mg/mL 蛋白酶K，混勻，在60 ℃下水浴2 h。加入500 μL酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1)，混勻后10 000 r/min離心4 min。吸上清，加入500 μL氯仿：異戊醇(24∶1)，10 000 r/min離心3 min后取上清液，加入30 μL 5 mol/L 的NaCl，1000 μL在4 ℃預(yù)冷的無水乙醇，混勻，冰上靜置10 min， 10 000 r/min離心3 min，棄上清。加入500 μL 70%乙醇，10 000 r/min離心2 min，棄乙醇，風(fēng)干約30 min，加入50 μL無菌水，渦旋，于-20 ℃儲(chǔ)存。

碘化鈉法[10]：取抗凝血樣品200 μL至2.0 mL EP管中，加入等量去離子水，顛倒混勻20下，室溫靜置2 min；加入400 μL 6 mol/L 碘化鈉溶液，顛倒混勻20下，室溫靜置2 min；加入800 μL在-20 ℃預(yù)冷的氯仿異戊醇混合液，上下震蕩混勻，室溫靜置2 min；12 000 r/min離心5 min后將上層的水相部分移至新的EP 管中，并加入0.6 倍體積的異丙醇及0.1倍體積3 mol/L、pH 5.2的醋酸鈉溶液，顛倒混勻，-20 ℃靜置5 min；12 000 r/min離心 5 min后倒掉離心管中的上清溶液，沿著離心管壁緩慢加入1000 μL預(yù)冷的70%乙醇，顛倒混勻，后12 000 r/min離心5 min；倒掉 EP 管中的乙醇，室溫靜置 5～10 min，直至離心管壁上無液體存在；在管底加入50 μL去離子水溶解DNA。

3種商品試劑盒的提取方法，均按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.5 不同方法提取DNA的濃度及純度評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)上述5種方法從綿羊全血提取總DNA的濃度、純度及完整性，利用各方法從含有布氏桿菌的綿羊血液樣本提取總DNA，使用Thermo Fisher NanoDrop One超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定提取DNA的OD260/OD280值和濃度。同時(shí)，各取4 μL DNA，采用1.0%的瓊脂糖進(jìn)行電泳，以評(píng)價(jià)各方法提取DNA的完整性。

1.6 引物設(shè)計(jì)及合成

采用文獻(xiàn)[11]報(bào)道的布氏桿菌特異性引物，引物序列見表1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息

引物引物序列(5′→3′)片段大小/bp退火溫度/℃BCSP31 B4TGGCTCGGTTGCCAATATCAABCSP31 B5CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG22359

1.7 不同方法提取布氏桿菌DNA的PCR擴(kuò)增

為評(píng)價(jià)5種方法提取DNA的效果以及最終對(duì)布氏桿菌PCR檢測(cè)的影響。以上述用不同方法提取的、含有不同濃度布氏桿菌的綿羊血液DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；后進(jìn)行35個(gè)94 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s的循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min后結(jié)束反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為20 μL：去離子水6 μL，PremixTaq10 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 不同方法的時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本比較

根據(jù)不同方法所使用試劑及操作過程，對(duì)各方法提取綿羊血液DNA的所需時(shí)間和成本進(jìn)行概算和比較。

2 結(jié)果

2.1 不同方法提取的DNA濃度、純度及完整性

采用3種試劑盒、酚/氯仿法及碘化鈉法，從含有布氏桿菌的綿羊全血中提取DNA，通過核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度及OD260/OD280值，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如表2及圖1。

表2 不同方法提取總DNA的純度和濃度

方法OD260/OD280DNA濃度/(μg/μL)AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit 1.88±0.0382.5±3.3TIANmp Blood DNA Kit1.42±0.0522.0±0.2DNeasy Blood & Tissue Kit1.73±0.0316.7±1.2碘化鈉法1.77±0.0595.9±1.8酚/氯仿法1.86±0.02637±3.0

從表2可知，TIANmp Blood DNA Kit 提取的DNA其OD260/OD280<1.6，表明提取的DNA有酚類或蛋白殘留；DNeasy Blood & Tissue Kit、碘化鈉法、AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit以及酚/氯仿法提取的DNA其OD260/OD280接近1.8左右，表明無明顯的蛋白及RNA污染。從獲取的DNA濃度來看，酚/氯仿法提取的DNA濃度最高，其次為碘化鈉法，而DNeasy Blood & Tissue Kit所得DNA濃度最低。

從圖1可以看出，各方法均得到了完整的總DNA分子，但在DNA濃度上有所差異，并與上述核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定的結(jié)果相一致。同時(shí)表明，酚/氯仿法提取DNA的電泳條帶不整齊，其點(diǎn)樣空處有雜質(zhì)殘留，說明可能含有較多的蛋白質(zhì)、酚類、糖或鹽等小分子雜質(zhì)。

2.2 不同提取方法對(duì)PCR檢測(cè)的影響

將不同濃度的布氏桿菌加入到綿羊血液中，并采用5種方法分別提取DNA，并作為模板，用布氏桿菌特異性PCR進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2。

M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000; 1. AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit；2. TIANmp Blood DNA Kit;3. DNeasy Blood & Tissue Kit；4.碘化鈉法；5.酚氯仿法

圖1 不同方法提取綿羊血液DNA的電泳分析

M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；N. 無模板對(duì)照;1～7. 每mL含1×106～1 CFU布氏桿菌的綿羊全血總DNA

圖2 不同DNA提取方法對(duì)布氏桿菌特異性PCR檢測(cè)的影響

以3種商品化試劑盒及碘化鈉法提取的DNA作為PCR模板，采用布氏桿菌特異性PCR可檢測(cè)到每mL綿羊血液中低至10 CFU的布氏桿菌，而采用酚/氯仿法提取的DNA為模板，PCR僅能從每mL含有1×106CFU布氏桿菌的綿羊血液獲得陽(yáng)性擴(kuò)增。

2.3 成本及時(shí)間效率概算

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)各方法提取DNA的時(shí)間效率以及經(jīng)濟(jì)成本，對(duì)各方法提取一個(gè)樣本所需時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本進(jìn)行概算，如表2。從所需時(shí)間上看，3種試劑盒所需時(shí)間相當(dāng)且最短，而酚氯仿法所需時(shí)間最長(zhǎng)近3 h，碘化鈉法所需時(shí)間為56 min。從提取的經(jīng)濟(jì)成本進(jìn)行估算，DNeasy Blood & Tissue Kit成本最高，每個(gè)樣本提取成本約35元，其次是AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit和TIANmp Blood DNA Kit，而酚氯仿法和碘化鈉法成本最低，僅約為1元。

3 討論

布氏桿菌病作為重要的人獸共患病，準(zhǔn)確、快速的診斷是對(duì)其進(jìn)行綜合防控的關(guān)鍵。目前常用的SAT、RBT以及ELISA等血清學(xué)方法雖然是對(duì)該病進(jìn)行診斷和流行病學(xué)調(diào)查的重要手段，但血清學(xué)方法作為間接診斷手段，檢測(cè)結(jié)果不僅受感染階段的影響，同時(shí)無法反映出感染的狀態(tài)，而病原學(xué)檢測(cè)可以為疾病的診斷提供直接證據(jù)。

表3 不同提取方法所需時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本概算

方法提取時(shí)間/min成本概算/元AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit 389TIANmp Blood DNA Kit387DNeasy Blood & Tissue Kit4035碘化鈉法561酚氯仿法1801

布氏桿菌感染動(dòng)物后，經(jīng)急性期感染，其菌體往往潛伏在淋巴結(jié)等組織，從而可進(jìn)入血液等體液[12-13]。血液是對(duì)布氏桿菌病進(jìn)行病原學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查的重要樣本之一，與淋巴結(jié)等其他組織樣本相比，采集方便，更具有可行性。此外，傳統(tǒng)的布氏桿菌的分離培養(yǎng)和鑒定技術(shù)不僅因生物安全等原因缺乏可操作性，而且從血液中進(jìn)行分離培養(yǎng)時(shí)，其敏感性遠(yuǎn)小于PCR等分子檢測(cè)方法[14]。

雖然對(duì)血液中布氏桿菌DNA進(jìn)行分子檢測(cè)是對(duì)布氏桿菌病診斷和流行病學(xué)調(diào)查的有用方法，然而不同報(bào)道中采用PCR對(duì)血液中布氏桿菌的檢測(cè)效果并不一致[14-16]。其重要原因之一是由于血液中往往存在更多PCR擴(kuò)增抑制物(如抗凝劑以及血紅蛋白等)[16]，因此，篩選使用良好DNA提取方法對(duì)于后續(xù)PCR檢測(cè)效果至關(guān)重要。

本研究對(duì)3種試劑盒以及酚/氯仿法和碘化鈉法提取綿羊全血中布氏桿菌DNA的效果和對(duì)PCR檢測(cè)的影響進(jìn)行了比較。其中，酚/氯仿法作為經(jīng)典的DNA提取方法，主要是利用十二烷基磺酸鈉、蛋白酶K、飽和苯酚和氯仿等成分有效地裂解細(xì)胞膜、去除蛋白質(zhì)從而獲得DNA。本研究結(jié)果表明，采用酚/氯仿法從綿羊血液提取總DNA，其得率(濃度)遠(yuǎn)高于其他方法，而且蛋白及RNA的污染較少，但采用該方法提取DNA時(shí)，利用PCR對(duì)綿羊血液布氏桿菌的檢測(cè)下限僅為1×106CFU/mL，遠(yuǎn)低于其他4種方法，分析其主要原因是由于該方法無法有效去除血液中的PCR抑制劑[17-18]。因此，酚/氯仿法不適合用于綿羊血液中布氏桿菌DNA提取。

基于硅膠膜的試劑盒法提取基因組 DNA 效率高并且可減少有機(jī)試劑對(duì)人體的傷害，近年來也得到了普遍的認(rèn)可和應(yīng)用。本研究的結(jié)果表明，盡管選擇的3種國(guó)內(nèi)外試劑盒提取的DNA純度有一定的差異，但均能有效提取綿羊血液中布氏桿菌的DNA，并能用于PCR敏感檢測(cè)。但是商業(yè)試劑盒成本較高，如不考慮成本的因素，試劑盒法最為理想。但在實(shí)際檢測(cè)過程中，需要大批量檢測(cè)樣本，基層單位在檢測(cè)過程中對(duì)成本的限制較大，需要在保證檢測(cè)品質(zhì)的同時(shí)降低成本，以適應(yīng)市場(chǎng)的需求。

碘化鈉法是利用在低滲的雙蒸餾水中,破壞血中紅細(xì)胞膜及白細(xì)胞膜,放出血紅蛋白及胞核，加入碘化鈉后破壞核膜并解離DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，再以氯仿/異戊醇抽提使蛋白質(zhì)變性，然后用異丙醇沉淀DNA從而獲得DNA。本研究采用碘化鈉法所獲得的DNA濃度較高，沒有蛋白和RNA污染，可以在短時(shí)間內(nèi)完成DNA的提取且價(jià)格低廉，經(jīng)PCR擴(kuò)增也可獲得目的條帶，因此可用于臨床大量血液樣本的批量提取、流行病學(xué)調(diào)查等，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

總之，本研究比較了5種方法對(duì)綿羊血液中布氏桿菌DNA的提取及PCR檢測(cè)的影響，碘化鈉法具有成本低、時(shí)間較短、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。基于硅膠膜的3種試劑盒，均能有效地提取血液中基因組 DNA，且配備成套試劑，具有安全、方便、規(guī)范的優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)成本較高，不適于基層單位在實(shí)際檢測(cè)中大批量樣本檢測(cè)。常規(guī)的酚氯仿法不能很好地去除混在樣本中的 PCR 抑制劑，故不利于 PCR 擴(kuò)增，因此不適于從綿羊血液中提取基因組DNA，有必要對(duì)其進(jìn)行改良。