RNA甲基化修飾m6A在動物中的研究進展

何波，周小楓，蔣瑤，曹浩男，袁曉龍，張哲，張豪，李加琪

( 華南農業大學動物科學學院， 廣東 廣州 510642)

RNA甲基化修飾具有復雜性和多樣性，在RNA約150多種化學修飾中，RNA甲基化修飾形式約占60%以上，各種甲基化修飾在細胞內有著不同的生物學功能[1]。RNA中m6A(N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤)的形成是在甲基轉移酶的催化作用下，將甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)上的甲基轉移到RNA腺嘌呤的第六位N原子上而得以實現的[2]，如圖1所示，在甲基轉移酶METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429等的催化作用下形成m6A，另外m6A甲基化形成后的腺嘌呤也能夠在去甲基化酶FTO、ALKBH5等的催化作用下脫去-CH3而實現去甲基化。m6A是真核細胞mRNA上最為常見的一類RNA甲基化修飾[3]，近年來受到廣泛的關注和研究。本綜述主要介紹和總結RNA甲基化修飾m6A的相關研究，簡要闡明m6A修飾的調控機制以及對動物繁殖、生長發育等各方面的影響。

圖1 mRNA中m6A甲基化修飾位點[3]

1 m6A的定位分布及基本調控機制

1.1 m6A的定位分布

m6A是真核生物中最常見和最豐富的mRNA甲基化修飾，據報道m6A修飾廣泛存在于酵母、植物、果蠅和哺乳動物等各類真核生物中[4]。在人類細胞和小鼠組織中，通過m6A抗體免疫沉淀結合高通量測序技術對m6A的轉錄組進行了全面的檢測，結果發現m6A定位分布主要在終止密碼子附近、3’UTRs、mRNA外顯子以及蛋白編碼區域(CDS)[5]。

1.2 m6A的基本調控機制

RNA中m6A甲基化修飾是由甲基轉移酶、去甲基化酶以及結合蛋白質的共同調控，近年來以m6A為主的RNA甲基化修飾研究表明，m6A與基因表達調控以及RNA的轉錄、翻譯、剪切、降解、核轉運等方面密切相關[6-7]。m6A甲基化修飾在細胞內由各種修飾酶和結合蛋白共同作用的動態可逆的修飾過程如圖2所示，m6A修飾的甲基化與去甲基化過程是由復雜的酶系統調控，其中m6A修飾的甲基化是在甲基轉移酶的催化作用下，將甲基供體SAM提供的甲基轉移到RNA分子特定的腺嘌呤上而形成的；m6A修飾的去甲基化同樣需要去甲基化酶的催化作用而脫去甲基；最終m6A甲基化修飾的功能發揮需要通過與相應的功能蛋白識別結合而得以實現。

1.2.1 m6A的調控酶系統

m6A甲基化的形成需借助甲基化轉移酶的作用將甲基供體SAM提供的-CH3轉移到RNA分子特定的腺嘌呤上，參與形成甲基化轉移酶復合體的蛋白主要包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429等，復合體的其它組分正在陸續被發現；m6A去甲基化需要去甲基化酶蛋白FTO和ALKBH5的作用脫去-CH3而實現[8]。

在動物機體中，各個酶都有著重要的生物學功能，METTL3主要參與調控腦組織發育和精子的發生[9-10]；METTL14能與METTL3形成一個穩定的異二聚體，對METTL3起到協同作用[11]；WTAP在m6A甲基轉移酶復合物中起調節亞基的作用，并在RNA代謝調節中發揮關鍵作用[12]；KIAA1429同樣對甲基轉移酶復合物的其它組分起到協同作用，也是m6A修飾的關鍵[13]，但由于KIAA1429的研究較少，KIAA1429對m6A水平的影響詳細機制尚不清楚，目前研究發現其主要參與調控胚胎干細胞的自我更新而參與胚胎的發育過程[14]；FTO和ALKBH5主要與動物肥胖和雄性動物精子的發生等方面有密切的關系[15-16]。

圖2 m6A修飾的動態調控過程[8]

1.2.2 m6A的功能結合蛋白

m6A甲基化修飾功能的發揮需要通過選擇性地與功能性的結合蛋白結合而得以實現。其功能性的結合蛋白主要包括YTHDF家族的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3以及YTHDC家族的YTHDC1等，這些蛋白可特異性結合在含有m6A修飾的序列上[17]，與mRNA的剪切、翻譯、降解等過程密切相關[8]，同樣在動物機體中發揮著重要的生物學功能。

YTHDF1與蛋白質翻譯有關，當YTHDF1結合m6A修飾的mRNA后，與起始轉錄因子及核糖體相互作用，核糖體結合到mRNA上的速度加快，增強mRNA的翻譯效率[18]；YTHDF2相較于YTHDF1對m6A修飾的序列有更強的結合能力，在細胞中，YTHDF2可選擇性地結合在mRNA的衰變位點上，進而影響mRNA的半衰期，加速mRNA的降解，影響mRNA的穩定性[19]；YTHDF3與YTHDF1能協同促進mRNA蛋白質翻譯合成，并且會影響YTHDF2介導的mRNA降解[20]；YTHDC1定位于細胞核的核斑點，通過結合mRNA的剪接因子來調控mRNA選擇性剪接，介導細胞mRNA從細胞核向細胞質的輸出而實現核轉運，對mRNA的加工和代謝有著重要的作用[21]。

2 m6A在動物中的生物學功能

2.1 m6A 與干細胞分化

2.1.1 m6A 調控神經干細胞分化

在動物胚胎發育和出生后腦組織發育過程中均需要神經干細胞的分化及自我更新作用，有研究發現在小鼠胚胎中敲除Mettl14后會導致神經中放射狀膠質細胞(radial glia cells，RGCs)周期進程中斷，最終導致腦皮層厚度減小，甚至會出現出生后死亡的現象。另外，m6A能抑制RGCs中與神經發生、細胞周期和神經元分化相關基因Sox1、Emx2、Cdk9等的表達，在小鼠胚胎中敲除Mettl3后導致RGCs細胞周期延遲，RGCs分化為神經元的能力顯著降低[22]。在成年小鼠坐骨神經損傷的脊神經節(dorsal root ganglion，DRG)中，許多與再生相關的基因和蛋白翻譯組分的m6A修飾水平明顯升高，當敲除Mettl14和Ythdf1會抑制成年小鼠DRG神經節損傷誘導的蛋白翻譯，外周神經系統的功能軸突再生減少，同時特異性敲除成年小鼠Mettl14基因后，中樞神經系統視網膜神經元軸突再生明顯減弱，表明m6A是成年哺乳動物神經系統損傷誘導蛋白質合成和軸突再生的一種重要表觀調控因素[23]。綜上表明，m6A修飾在哺乳動物大腦神經干細胞分化、神經系統發育過程中有著重要的生物學功能。

2.1.2 m6A 調控造血干細胞分化

相關研究通過m6A抗體免疫沉淀結合高通量測序技術分析，發現m6A在斑馬魚胚胎發育的內皮-造血轉換過程(endothelial-to-haematopoietic transition，EHT)中決定著造血干/祖細胞(haematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs)的分化；其調控過程是m6A通過特異性修飾ETH過程中關鍵的動脈內皮基因Notch1a，使得結合蛋白YTHDF2對該基因的mRNA進行降解，抑制了調控EHT過程的Notch信號通路，促進內皮細胞轉化為HSPCs，從而使得EHT過程有序進行；在斑馬魚胚胎中敲除Mettl3后會導致m6A水平顯著降低，動脈內皮基因Notch1a的mRNA無法降解使得Notch信號通路持續激活，導致EHT過程被阻斷，進而阻滯HSPCs的分化[24]，表明m6A在動物造血干細胞分化過程中有著重要的調控作用。

2.1.3 m6A調控胚胎干細胞分化

相關研究發現在小鼠早期胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)中大部分基因轉錄組都存在m6A修飾，當特異性敲除小鼠ESCs的Mettl3基因后能顯著降低m6A修飾水平和ESCs的分化以及自我更新能力[25]。另一項類似的研究中，小鼠胚胎干細胞中Mettl3或Mettl14基因特異性敲除會導致ESCs中m6A修飾水平顯著降低，表明m6A修飾的形成需要這兩種蛋白；為了研究這兩種蛋白METTL3和METTL14在ESCs中的分子生物學功能，采用RNA免疫沉淀技術和高通量測序技術結合，繪制基因表達圖譜以及對m6A修飾進行定位。首先，發現當Mettl3或Mettl14基因缺失時，超過70%的ESCs中的mRNA的m6A水平顯著降低；其次，Mettl3或Mettl14的缺失也會導致小鼠ESCs分化相關基因表達降低，小鼠ESCs自我更新能力降低，表明Mettl3或Mettl14介導的m6A修飾有助于維持小鼠ESCs的分化；最后，對測序結果的分析還發現ESCs中編碼發育調節因子的mRNA中高度富集m6A，當Mettl3和Mettl14基因缺失時，部分發育調節因子mRNA穩定性增強，表明m6A修飾會選擇性地破壞了ESCs中發育調因子mRNAs的穩定性[26]。另外，在小鼠的研究上還發現，甲基化轉移酶復合體中KIAA1429在小鼠ESCs自我更新中也具有重要作用，Kiaa1429基因被特異性敲除后會影響ESCs的細胞活力，同時會導致胚胎發育阻滯，胚胎在小鼠出生前出現死亡的現象[14]。綜合以上研究結果表明，m6A甲基轉移酶METTL3、METTL14、KIAA1429在維持ESCs分化、自我更新以及胚胎發育中發揮著重要的作用。

2.2 m6 A與動物繁殖

2.2.1 m6A調控動物精子發生

研究表明通過特異性敲除小鼠生殖細胞中Mettl3基因，發現介導基因選擇性剪接的Mettl3缺失會導致精子發生過程中相關基因的表達模式紊亂、精子發生過程中減數分裂嚴重缺陷、精子發生受阻，最終導致不育[9]。在另外一項研究中，特異性敲除小鼠生殖細胞中Mettl3和Mettl14基因同樣會導致m6A水平下降，引起精原干細胞增殖和分化相關基因的表達失調，最終導致精子發生受阻[27]。在雄性小鼠睪丸中，m6A去甲基化酶ALKBH5的表達水平最高，敲除Alkbh5后會導致m6A水平上升，睪丸體積變小、精子形態異常以及出現一系列的生殖功能障礙[16]。相關研究還發現，YTHDC2調控生殖細胞從增殖向分化的轉變，轉錄組分析進一步發現，Ythdc2基因的缺失還會導致正常有絲分裂細胞相關基因表達的上調，而減數分裂相關基因的表達下調[28]。綜上研究結果表明，m6A 甲基化修飾的動態調控過程與精子發育發生密切相關，各調控酶和結合蛋白發揮著極其重要的生物學功能。

2.2.2 m6A調控動物卵母細胞成熟

卵母細胞減數分裂是一個較為復雜過程，相關研究發現在豬卵母細胞減數分裂過程中m6A總體水平顯著升高，同時m6A甲基化轉移酶METTL3和WTAP和去甲基化酶FTO表達水平均有升高，在體外分別用甲基供體苷氨酸三甲內鹽，俗稱甜菜堿和甲基化抑制劑環亮氨酸處理卵母細胞，發現甲基供體處理的卵母細胞的m6A水平顯著升高，但不影響減數分裂過程和卵母細胞發育；而甲基化抑制劑處理的卵母細胞后導致減數分裂過程中m6A甲基化水平降低，且細胞內紡錘體和染色體的缺陷發生率顯著增加，卵母細胞發育不完全，表明m6A甲基化修飾的水平降低會損害減數分裂過程卵母細胞的發育能力，阻礙其成熟[29]。YTHDF2能與m6A修飾的mRNA結合并使其降解，在小鼠上發現Ythdf2基因的高表達能促進減數分裂過程中卵母細胞的發育成熟，Ythdf2基因缺失的小鼠會出現不孕不育現象，表明m6A結合蛋白YTHDF2是哺乳動物卵母細胞和早期受精卵發育的決定因素[30]。

2.3 m6 A與動物生長發育

2.3.1 m6A調控動物能量代謝及脂肪沉積

在豬脂肪細胞中過表達和特異性敲除Fto和Mettl3基因，發現FTO表達水平與m6A水平呈負相關，與脂肪形成呈正相關，而METTL3表達水平與m6A水平呈正相關，與脂肪形成呈負相關[31]。FTO功能性缺失的小鼠出生后會出現能量消耗增加、生長遲緩、體型偏瘦，同時還會引起嚴重的生長遲緩和畸形[32]；在小鼠上研究還發現，肥胖相關基因Irx3是Fto的功能靶點，兩者可以相互作用，增加動物機體的脂肪沉積，從而導致動物出現肥胖現象，Fto和Irx3缺失的小鼠，脂肪沉積減少和能量代謝率增加，從而表現出體重嚴重下降和體型出現異常等情況[33]。綜上，這些結果揭示了m6A在動物能量代謝、脂肪沉積形成等方面有著重要的作用。

2.3.2 m6A調控動物肌肉生長

相關研究采用m6A抗體免疫共沉淀結合高通量測序技術，將野豬、長白豬和榮昌豬三個不同品種的肌肉組織進行轉錄組測序，繪制出了m6A全轉錄組圖譜，結果發現m6A在肌肉組織中廣泛分布，m6A主要富集于相關基因的終止密碼子、3′UTR和蛋白編碼區。另外，該研究通過m6A-IP數據顯示，發現在cAMP反應元件結合蛋白CREB和鋅指蛋白ZNF相關基因的終止密碼子周圍均有一個清晰的m6A峰，說明m6A在此富集；Creb最早被發現為細胞代謝調節cAMP反應的轉錄調控因子，是重要的調控生長抑素的基因，ZNF也一直被認為是最重要的真核轉錄因子之一，對基因的調控起重要作用。該研究中發現還有大量含有m6A修飾的基因與轉錄因子相關，表明m6A修飾可能與轉錄因子結合調控基因轉錄[34]。

2.3.3 m6A調控動物腦組織發育

相關研究發現在小鼠小腦發育過程中廣泛存在m6A修飾，并進一步研究揭示了小鼠出生后腦組織四個發育進程中m6A甲基化修飾的不同特征。在小鼠出生后的7-60天里，mRNA的m6A水平表現出明顯的變化，各種修飾酶METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5、FTO在小鼠小腦中的時間和空間上均出現特異性表達；Alkbh5基因缺失會擾亂不同細胞中決定性基因m6A修飾的平衡，導致小腦細胞增殖和分化異常[35]；另一項研究發現在小鼠神經系統中，METTL3甲基轉移酶的特異性滅活會引起大腦發育出現嚴重缺陷現象，小腦中m6A修飾水平明顯下降，Mettl3基因特異性敲除會導致在小腦外顆粒層中的顆粒細胞(cerebellar granulosa cells，CGCs)凋亡明顯增加，進而影響小腦發育不完全，進一步分析結果表明，甲基轉移酶METTL3介導的m6A通過調控與小腦發育和凋亡相關基因的mRNA穩定性以及調節突觸相關基因mRNA的選擇性剪接來參與小腦的發育[10]。綜上，這些結果共同揭示了甲基化轉移酶和去甲基化酶介導的m6A在調節哺乳動物腦組織發育中具有重要作用。

3 結語與展望

首先，RNA中m6A修飾是一個由甲基轉移酶、去甲基化酶及結合蛋白共同調控的動態過程，整個過程由于存在多種甲基化修飾酶和結合蛋白而使得其調控機制和調控過程極為復雜。例如在m6A復雜的調控酶系統中，RNA甲基轉移酶是一個包含多個組分的酶復合體，盡管隨著科學技術發展，甲基轉移酶復合物其它組分在陸續被發現，但可能還存在更多的m6A甲基轉移酶或是去甲基化酶，需要進一步的研究挖掘，才可以更清晰地闡述m6A甲基化修飾的調控機制；另外m6A修飾不僅在動物繁殖、生長發育方面有著不言而喻的重要性，而且在調節動物生物節律方面以及機體的一系列病理效應中也起著關鍵作用[8]，這也是未來在RNA分子水平方面的研究方向。

其次，目前RNA甲基化修飾的研究在人類中較多，雖然近年來越來越多的研究表明，RNA甲基化修飾在調控動物繁殖、生長發育方面有著重要的作用，但只是以小鼠為基礎模型的研究，在一些重要的畜牧生產動物，如豬、牛、羊、雞上的研究均相對較少，所以在這些重要的畜牧生產動物方面是值得去思考和進一步研究的。一方面，RNA甲基化修飾是否會對這些畜牧生產動物的生產性能和繁殖性能產生同樣的影響等；另一方面，既然RNA甲基化修飾的過程受到甲基化轉移酶和去甲基化酶共同作用，那么對于m6A甲基化修飾的化學干預與調控的小分子藥物的研發便是未來的研究方向，這些藥物作為一種抑制劑或促進劑靶向作用于相應的酶，從而改變RNA甲基化修飾水平，應用于動物疾病預防與治療等方面，目前已有相關研究報道了RNA去甲基化酶FTO的靶向抑制劑[8]；同樣，m6A甲基化修飾的功能發揮需要借助結合蛋白的作用，這些結合蛋白的合成必定受到相關分子路徑的調控作用，研究并闡明這些功能結合蛋白的分子調控機制，也可以有效地改變RNA甲基化修飾的對于動物機體的作用，這也是未來一個重要的研究方向。

最后，在現代集約化養殖生產中，提高動物的生產性能和繁殖性能對于提高經濟效益極為重要，提高動物生產性能和繁殖性能也是養殖生產的最終目的。因此就可以從RNA甲基化修飾的分子調控機制研究入手，更加清楚地闡述在畜牧生產動物上的分子調控機制，進而通過有效的手段改變RNA分子甲基化修飾的水平來減少對于畜牧生產動物產生的負面影響，更好發揮動物的優良的生產性能和繁殖性能，最終達到提高畜禽動物的產蛋率、產肉率、受胎率、產仔數，產肉率、產奶量等目的；同時也可以對RNA甲基化修飾在不同品種動物之間表現出的差異性進行研究，找出不同品種之間的存在的差異，在實際生產中更好地進行畜禽的選種育種工作，選擇更加優良的品種進行養殖生產，在提高經濟效益的同時，對于推動整個畜牧業的優質、健康、高效發展有著重要意義。