促皮質素制備工藝中病毒滅活能力的驗證

汪雅雯 孫源遠 黃臻輝

摘 要 目的：對促皮質素進行病毒滅活工藝驗證。方法：選擇非脂包膜病毒EMCV、PPV和ReoV-3用于驗證加熱處理步驟的病毒滅活能力，選擇脂包膜病毒PRV、VSV和BVDV用于驗證丙酮沉淀處理步驟的病毒滅活能力。結果：加熱處理步驟可有效滅活非脂包膜病毒，丙酮沉淀處理步驟可有效滅活脂包膜病毒。結論：本次驗證為促皮質素的病毒安全性評價提供了依據。

關鍵詞 促皮質素 制備工藝 病毒滅活

中圖分類號：TQ464.51 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）03-0069-03

Verification of the ability of virus inactivation in corticotrophin production

WANG Yawen*， SUN Yuanyuan， HUANG Zhenhui

（SPH NO.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To verify the process for virus inactivation in the production of corticotrophin. Methods： Virus inactivation was verified by heating for non-lipid enveloped viruses such as EMCV， PPV and ReoV-3 and by acetone precipitation for lipid enveloped viruses such as PRV， VSV and BVDV. Results： The non-lipid enveloped virus could be effectively inactivated by heating while the lipid enveloped virus by acetone precipitation. Conclusion： This verification can provide a basis for the evaluation of virus safety in the production of corticotrophin.

KEY WORDS corticotrophin； preparation process； inactivation procedure of viruses

促皮質素，即促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）來源于豬、牛、羊的腦垂體前葉，常見制備步驟包括鹽酸丙酮法提取（加熱）、丙酮沉淀和丙酮脫水等工序。參照《多組分生化藥注射劑基本技術要求》[1]、《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》生化藥品附錄[2]、《生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價技術審評一般原則》[3]和《血液制品去除滅活病毒技術方法及驗證指導原則》[4]的規定，結合促皮質素工藝情況，選擇加熱處理和丙酮沉淀處理考察促皮質素制備工藝中滅活病毒的能力。加熱處理滅活病毒的原理主要是加熱可使衣殼蛋白和病毒外膜蛋白變性，從而導致病毒包膜上糖蛋白棘突結構發生變化，阻止病毒吸附于宿主細胞；同時，加熱使得病毒復制所需的酶類失活，阻止病毒復制。加熱滅活病毒是非特異性的，對脂包膜病毒和非脂包膜病毒均可滅活[5]。丙酮作為一種脂溶劑，可破壞包膜結構從而殺死病毒。病毒感染性滴度減少≥4 log的處理步驟認可為有效的病毒去除/滅活工藝步驟[3-4]。

1 材料與方法

1.1 樣品

3批次垂體前葉粉（促皮質素制備工藝中的起始物料），用于加熱處理步驟病毒滅活驗證試驗。

3批次垂體前葉沉淀前濾清液（以下簡稱“濾清液”，為促皮質素制備工藝中的中間體），用于丙酮沉淀處理步驟病毒滅活驗證試驗。

1.2 指示病毒

考慮指示病毒的相關性、基因組、有無包膜和理化抗性等因素，同時結合促皮質素病毒滅活驗證工藝，選擇了6種具有代表性的指示病毒，其中非脂包膜病毒腦心肌炎病毒（EMCV）、豬細小病毒（PPV）和牛呼腸孤病毒3型（ReoV-3）驗證加熱處理步驟的病毒滅活能力，脂包膜病毒偽狂犬病毒（PRV）、水皰性口腔炎病毒（VSV）和牛腹瀉病毒（BVDV）驗證丙酮沉淀處理步驟的病毒滅活能力（表1）。

1.3 病毒滅活驗證方法

1.3.1 加熱處理步驟

準確稱取垂體前葉粉，加入7倍量（W/V）丙酮35 ml，3倍量（W/V）1 mol/L HCl溶液15 ml，攪拌溶解15 min后，置于（51±1）℃恒溫水浴鍋中，待樣品升溫至50 ℃，按25∶1（樣品-病毒，V∶V）比例加入指示病毒2 ml，混勻后開始計時，分別于0、5、15、30和60 min時取樣，測定各取樣時間點的病毒滴度。

同時設置相同工藝時間內病毒在不含HCl的中性室溫條件下的中性對照和不含HCl的（51±1）℃中性保溫條件下的加溫對照，以及病毒在室溫條件下的酸性對照，并考察升溫至50℃的過程對指示病毒的影響。

1.3.2 丙酮沉淀處理步驟

用移液器準確吸取9 ml濾清液，共計6份，按9∶1（濾清液-病毒，V∶V）的比例分別加入指示病毒1 ml，混勻。取其中1份，加入7倍量純水70 ml，其余5份分別按1∶7（樣品-冷丙酮，V∶V）的比例加入冷丙酮70 ml，攪拌混勻后置于（1±1）℃恒溫液浴循環兩用槽中靜置沉淀，開始計時，于0、5、15、30和60 min時各取出1份，3 000 r/min離心1 min，分離上清和沉淀，純水復溶沉淀至原體積，取樣測定上清和沉淀復溶液中的病毒滴度。

同時設置相同工藝時間內病毒在中性濾清液中的純水對照和酸性濾清液中的酸性對照，并考察丙酮對中性濾清液中指示病毒的滅活作用。

參照《動物病毒學》（第二版）（四）病毒感染力的滴定標準[6]，應用微量病變法測定工藝處理前后各批次樣品中的病毒滴度。按Reed-Muench法計算病毒滴度（以半數細胞感染劑量TCID50表示，TCID50對數值= 高于50%組病變的病毒最高稀釋度的對數值+距離比例），并計算處理前后病毒滴度的下降值。

2 結果

2.1 細胞毒性試驗

指示病毒BVDV采用MDBK細胞培養，VSV和EMCV采用Vero細胞培養，PRV和PPV采用ST細胞培養，ReoV-3采用LLC-MK2細胞培養。將各樣品進行10～100倍稀釋，接種于各指示細胞（MDBK細胞、Vero細胞、ST細胞或LLC-MK2細胞）進行細胞毒性試驗。

結果表明，垂體前葉粉溶解液和經加熱后的溶液50倍稀釋度對Vero細胞、ST細胞和LLC-MK2細胞生長均無影響，加熱步驟指示病毒EMCV、PPV和ReoV-3的滴度最低檢測限均為1.7 logs；濾清液和丙酮沉淀后的上清和沉淀復溶液50倍稀釋度對MDBK細胞、Vero細胞和ST細胞生長均無影響，丙酮沉淀步驟指示病毒BVDV、PRV和VSV的滴度最低檢測限均為1.7 logs。

2.2 加熱處理步驟滅活指示病毒的結果

3批次垂體前葉粉中加入7倍量丙酮和3倍量1 mol/L HCl攪拌溶解15 min后，置于恒溫水浴鍋中升溫至50 ℃，加入指示病毒，混勻后立即取樣，3批次樣品中EMCV、PPV和ReoV-3滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值分別≥4.9 logs、≥4.3 logs和≥4.3 logs。

在中性對照中，3批次垂體前葉粉中加入7倍量丙酮和3倍量純水攪拌溶解15 min后加入指示病毒，混勻后室溫靜置60 min，3批次樣品中EMCV、PPV和ReoV-3滴度平均下降值分別為0.8 logs、0.4 logs和1.0 logs。表明相同工藝時間內中性垂體前葉粉溶解液對EMCV、PPV和ReoV-3基本無滅活作用。

在酸性對照中，3批次垂體前葉粉中加入7倍量丙酮和3倍量1 mol/L HCl攪拌溶解15 min后加入指示病毒，在加入瞬間，3批次樣品中EMCV、PPV和ReoV-3滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值分別≥4.9 logs、≥4.3 logs和≥4.3 logs。表明相同工藝時間內樣品中的酸性條件對EMCV、PPV和ReoV-3具有快速滅活作用。

在加溫對照中，3批次垂體前葉粉中加入7倍量丙酮和3倍量純水攪拌溶解15 min后，置于恒溫水浴鍋中升溫至50 ℃后，加入指示病毒，經（51±1）℃保溫滅活60 min，3批次樣品中EMCV和ReoV-3滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值分別≥4.9 logs和≥4.3 logs；而PPV滴度平均下降值為1.5 logs。表明相同工藝時間內（51±1）℃保溫對EMCV和ReoV-3具有滅活作用，對PPV具有一定的滅活作用。

在升溫對照中，3批次垂體前葉粉中加入7倍量丙酮和3倍量1 mol/L HCl攪拌溶解15 min后加入指示病毒，將其置于恒溫水浴鍋中升溫至50 ℃，在該升溫過程中，3批次樣品中EMCV、PPV和ReoV-3滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值分別≥4.9 logs、≥4.3 logs和≥4.3 logs。表明該升溫過程對EMCV、PPV和ReoV-3具有滅活作用。

將3批次加熱30 min的樣品（50倍稀釋度）的測定細胞孔分別進行盲傳3代，指示細胞均正常生長，盲傳3代無病變，表明指示病毒EMCV、PPV和ReoV-3均被完全滅活。

上述結果表明，加熱處理步驟能有效滅活非脂包膜指示病毒EMCV、PPV和ReoV-3，該滅活工藝中的酸性條件和（51±1）℃水浴保溫均對指示病毒具有滅活作用。

2.3 丙酮沉淀處理步驟滅活指示病毒的結果

3批次濾清液中加入指示病毒和7倍量冷丙酮，攪拌混勻后立即于3 000 r/min離心1 min，純水復溶沉淀至原體積。從上清中取樣，3批次上清中BVDV、PRV和VSV滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值分別≥4.4 logs、≥4.5l ogs和≥4.3 logs；從沉淀復溶液中取樣，3批次沉淀復溶液中BVDV、PRV和VSV滴度平均下降值同上清中的滴度平均下降值。

在丙酮對照中，3批次染毒中性濾清液中加入7倍量冷丙酮后立即于3 000 r/min離心1 min，純水復溶沉淀至原體積。從上清中取樣，3批次上清中BVDV、PRV和VSV滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值分別≥4.4 logs、≥4.5 logs和≥4.3 logs；從沉淀復溶液中取樣，3批次沉淀復溶液中BVDV滴度平均下降值為4.1 logs、而PRV和VSV滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值分別≥4.5 logs和≥4.3 logs。表明相同工藝時間內丙酮對指示病毒BVDV、PRV和VSV均具有快速滅活作用。

在純水對照中，3批次濾清液中加入7倍量純水，調節pH至中性，加入指示病毒，攪拌混勻后隨試驗組于（1±1）℃水浴靜置60 min，3批次樣品中BVDV、PRV和VSV滴度平均下降值分別為0.8 logs、0.7 logs和0.7 logs。表明不含丙酮的中性樣品對BVDV、PRV和 VSV均無滅活作用。

在酸性對照中，3批次染毒濾清液中加入7倍量純水，混勻后立即取樣，3批次樣品中BVDV、PRV和VSV滴度平均下降值分別為1.2 logs、4.0 logs和3.9 logs。取樣后的樣品隨試驗組于（1±1）℃水浴靜置60 min，3批次樣品中BVDV滴度平均下降值為2.2 logs、而PRV和VSV滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值分別≥4.5 logs和≥4.3 logs。表明該酸性條件對BVDV具有一定的滅活作用，對PRV和VSV均具有快速滅活作用。

將3批次丙酮沉淀30 min的上清（50倍稀釋度）和沉淀復溶液（50倍稀釋度）的測定細胞孔分別進行盲傳3代，指示細胞均正常生長，盲傳3代無病變，表明指示病毒BVDV、PRV和VSV均被完全滅活。

上述結果表明，丙酮沉淀處理步驟對脂包膜指示病毒（BVDV、PRV和VSV）均具有快速滅活作用，濾清液本身的低pH條件對病毒同樣具有滅活作用。

3 結語

促皮質素制備工藝中的兩個工藝步驟（加熱處理和丙酮沉淀處理）重復性高、實驗數據和結果穩定，且兩個工藝步驟原理不同、能從機制上互補。加熱處理步驟可有效滅活非脂包膜指示病毒（EMCV、PPV和ReoV-3），丙酮沉淀處理步驟可有效滅活脂包膜指示病毒（BVDV、PRV和VSV）。本次驗證試驗為該品種的病毒安全性評價提供了依據。

致謝：感謝王小良、吳娟對本文的貢獻。

參考文獻

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[2] 國家藥品監督管理局. 總局關于發布《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》生化藥品附錄的公告（2017年第29號）[EB/OL]. （2017-03-16）[2019-04-08]. http：//www. nmpa.gov.cn/WS04/CL2138/300305.html.

[3] 國家藥品監督管理局藥品審評中心. 生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價的技術審評一般原則[EB/OL]. （2007-08-23）[2019-04-08]. http：//www.cde.org. cn/zdyz.do？method=largePage&id=2082.

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[6] 殷震， 劉景華. 動物病毒學[M]. 北京： 科學出版社， 1997： 329-331.