UPLC-MS/MS測定14-羥基蕓苔素甾醇

王菲迪，王莉，吳聲敢，蔣金花，柳新菊，安雪花，呂露，趙學平

(浙江省農業科學院農產品質量標準研究所 省部共建農產品質量安全國家重點實驗室(籌)農業農村部農藥殘留檢測重點實驗室，浙江 杭州 310021)

14-羥基蕓苔素甾醇是一種結構新穎的油菜素甾醇(Brassinosteroid，BRs)激素。BRs是一類多羥基的類固醇植物激素，被譽為繼生長素、乙烯、脫落酸、赤霉素、細胞分裂素后的第六類植物內源性激素[1]。BRs能夠調節植物生長發育，具有高效、廣譜、無毒的特點，在農業生產中應用廣泛[1]。14-羥基蕓苔素甾醇制備時主要以花粉為原料，采用酶法水解萃取進行提取、分離和純化，具有良好的蕓苔素內酯活性[1]。14-羥基蕓苔素甾醇分子式為C27H46O7，化學名稱為(20R，22R)-2β，3β，14，20，22，25-六羥基-5β-6-酮。包括14-羥基蕓苔素甾醇在內的BRs分子中缺乏對光、電高響應的官能團，且揮發性差，較難離子化[2]。檢測時，最常見的思路是利用甾醇分子中特征的順式鄰二羥基與烴基硼酸結合，引入生色團或電活性基團，再利用質譜、紫外、熒光或電化學檢測器進行檢測[2]。衍生化操作繁瑣，不經衍生化直接用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)可對14-羥基蕓苔素甾醇直接進行檢測。吳進龍等[3]以萘硼酸為衍生化試劑，以甲醇為溶劑進行衍生化反應，采用HPLC-DAD對衍生化產物進行檢測，此法定量限(LOQ)為25.0 mg·L-1。其團隊還采用HPLC-ELSD對14-羥基蕓苔素甾醇直接進行檢測，LOQ為16.1 mg·L-1[4]。根據報道，其他種類蕓苔素甾醇的分析方法也通常著眼于生物檢測、衍生化分析和免疫分析等手段，但生物檢測穩定性差，難以準確定量，衍生化方法操作繁瑣，免疫分析成本高，且高度轉移[2]。而超高效液相色譜-串聯質譜分析方法(UPLC-MS/MS)具有高效、分離度高、靈敏度高等特點，是蕓苔素甾醇檢測技術發展的一個趨勢。本研究通過UPLC-MS/MS，建立更靈敏、選擇性更高的分析方法，旨在為蕓苔素甾醇的分析檢測提供一定的研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ABSciex液相色譜串聯三重四級桿質譜聯用儀(Exion LCAD-Triple QuadTM 5500，美國ABSciex公司)；CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.6 μm，美國Waters公司)；BSA224S 電子天平(感量0.000 1 g，德國賽多利斯集團)；MX-S可調式混勻儀(北京大龍興創實驗儀器有限公司)。

14-羥基蕓苔素甾醇標準品(純度99.0%，成都新朝陽作物科學有限公司)；色譜純乙腈(德國Merck公司)；色譜純甲酸和色譜純乙酸銨(Anaqua Chemicals Supply公司)；飲用純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.2 標準溶液配制

準確稱取適量14-羥基蕓苔素甾醇標準品，用乙腈溶解，配成濃度為1.19×103mg·L-1的標準儲備液，再用乙腈逐級稀釋，得到濃度為10.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.010和0.005 mg·L-1的標準工作液。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

取5.0 mL水樣，加入5.0 mL乙腈，渦旋1 min混勻。用乙腈將混勻后的溶液稀釋5倍，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.3.2 檢測條件

液相條件。色譜柱CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.6 μm，美國Waters公司)。流動相：A為0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：起始比例A為5%；0～0.5 min，A維持5%；0～0.5 min，A升至30%，然后維持至3.5 min；3.5～4.0 min，恢復至起始梯度平衡系統，維持至6.0 min。流速0.25 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣體積5.00 μL；峰面積外標法定量。

質譜條件。毛細管電壓-4.5 kV，氣簾氣35 psi，噴撞氣7 psi，噴霧氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，離子源溫度550 ℃，射入電壓-10 V，碰撞室射出電壓-16 V。定性、定量模式均為MRM多反應監測模式，電離方式為ESI-。14-羥基蕓苔素甾醇的定量離子對(去簇電壓、碰撞能)為m/z541.2>159.2(-100 V，-40 V)，定性離子對(去簇電壓、碰撞能)為m/z541.2>347.5(-100 V，-36 V)。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

14-羥基蕓苔素甾醇分子中缺乏對光、電高響應的官能團，較難離子化，因此質譜檢測時母離子和子離子的確定很困難。分別在ESI+和ESI-兩種電離方式下對14-羥基蕓苔素甾醇的母離子進行掃描，最終確認母離子為[M+CH3COO-]的離子，常見的[M+H+]和[M+Na+]等信號均較弱，然后確定子離子，優化了碰撞能量、去簇電壓等參數。

2.2 色譜條件的優化

分別考察ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱、CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱及ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱對14-羥基蕓苔素甾醇的分離分析性能。14-羥基蕓苔素甾醇極性較大，在ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱和ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱上基本無保留，1 min內就出峰，且穩定性差，故最終選擇適合分離分析極性化合物的CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱。

考察乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液、乙腈-2 mmol·L-1乙酸銨水溶液及甲醇-2 mmol·L-1乙酸銨水溶液等流動相對14-羥基蕓苔素甾醇的色譜峰形和響應值的影響。最終確定流動相為乙腈-0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液，在該流動相體系下，色譜峰形相對較好且穩定。

2.3 前處理方法的優化

分別采用了乙酸乙酯提取、二氯甲烷提取、乙腈提取和乙腈定容的方法進行了添加回收試驗。結果表明，乙酸乙酯提取、二氯甲烷提取和乙腈提取方法的回收率均較低，未能滿足農藥檢測要求，而乙腈定容后再稀釋的方法的添加回收率滿足檢測要求。因此，最終選擇了乙腈定容的前處理方法對14-羥基蕓苔素甾醇進行檢測。

2.4 方法的線性范圍

將0.005、0.010、0.050、0.100和0.200 mg·L-1的14-羥基蕓苔素甾醇標準工作溶液進儀器進行檢測。以濃度為橫坐標，分別對應的峰面積為縱坐標制作標準曲線，計算回歸方程和相關系數，得到回歸方程為y=279 012x+1 521，相關系數R2=0.992 7，表明14-羥基蕓苔素甾醇在0.005～0.200 mg·L-1濃度線性良好。

2.5 方法的準確度、精密度和定量限

在不含14-羥基蕓苔素甾醇的空白水樣中，通過添加回收試驗，考察了方法的準確度和精密度(n=5)。表1表明，14-羥基蕓苔素甾醇在0.1、1.0、11.9 mg·L-1添加水平下，平均回收率在101%～106%，相對標準偏差在3.29%～5.82%，滿足檢測分析的要求。根據添加回收，確定14-羥基蕓苔素甾醇的定量限(LOQ)為0.1 mg·L-1。

表1 14-羥基蕓苔素甾醇的添加回收率和相對標準偏差

3 小結

本研究建立了14-羥基蕓苔素甾醇的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法，該方法簡單、快速、高效、靈敏，檢出限最低可到0.1 mg·L-1，能夠滿足14-羥基蕓苔素甾醇殘留量的檢測要求，為蕓苔素甾醇的分析方法提供了一定的研究思路。但今后仍需發展更為靈敏的檢測方法，如發展操作簡易、響應靈敏的新型衍生化試劑，與液相色譜-串聯質譜相結合，為蕓苔素甾醇這類新型植物生長調節劑的風險監控提供強有力的支持。