HPLC法同時(shí)測(cè)定茶葉中兒茶素類和咖啡因的含量

楊金川, 白雪梅

(1.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)檢驗(yàn)院, 貴州 貴陽(yáng) 550001; 2.貴州省市場(chǎng)監(jiān)督管理局, 貴州 貴陽(yáng) 550001)

茶葉起源于中國(guó)，是我國(guó)豐富的天然資源，并因其具有多種生理作用和藥理活性，受到眾多學(xué)者的關(guān)注，在活性成分茶多酚和咖啡因方面的研究較多。茶多酚(Tea polyphenol)，又稱維多酚，是茶葉中30多種酚類物質(zhì)的總稱，約占茶葉干物質(zhì)總量的25%～35%，主要包括兒茶素、黃酮類化合物、花青素和鞣酸四大類物質(zhì)，其中以兒茶素含量最多，約占茶多酚總量的 65%～80%[1]。茶多酚具有抗衰老、抗疲勞、抑制腫瘤、抗菌、降血脂和降血糖等藥理作用[1]，而兒茶素類是茶多酚中的主要成分，也是其主要的藥理活性物質(zhì)，其主要有沒食子酸(GA)、表兒茶素(EC)、兒茶素(+C)、表沒食子兒茶素(EGC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、沒食子兒茶素(GC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)，因此也是茶葉品質(zhì)和茶多酚產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)；咖啡因(Caffeine)也是茶葉的主要成味物質(zhì)和生理活性成分，具有多種生理作用，能作為藥品使用，具有興奮神經(jīng)樞、強(qiáng)心、促進(jìn)葡萄糖代謝、利尿、助消化及解毒等功效，但是兒童攝入過(guò)量咖啡因可誘使多動(dòng)，長(zhǎng)期食用會(huì)產(chǎn)生依賴性[2]。檢測(cè)茶葉及茶制品中各種兒茶素及咖啡因的含量對(duì)于評(píng)價(jià)其功能品質(zhì)具有重要意義。

目前，茶葉茶多酚中兒茶素類和咖啡因的檢測(cè)主要有高效液相色譜法[3-4]、超高效液相色譜法[5]、液相色譜質(zhì)譜法[6]和超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜[7]等，檢測(cè)中多采用梯度洗脫，易出現(xiàn)基線不平、分離度差、重現(xiàn)性差、分析時(shí)間長(zhǎng)和對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求高等問(wèn)題。為此，以綠茶和紅茶中GA、GC、EGC、+C、ECG、EGCG、EC、GCG和CAF為研究對(duì)象，探索新的色譜分離條件，使得樣品中所有兒茶素類化合物和咖啡因均得到良好的分離，并采用HPLC進(jìn)行測(cè)定，以期為茶葉產(chǎn)品的等級(jí)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶葉樣品：湄潭翠芽、都勻毛尖、云霧毛峰、遵義紅紅茶、紅寶石紅茶，均購(gòu)于永輝超市。

儀器：Agilent-1260高效液相色譜儀(配UVD) ，安捷倫科技有限公司；Milli-Q Academic超純水儀，密理博中國(guó)有限公司；DK-98-11電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 穩(wěn)定溶液的制備 將25 mL EDTA溶液 (10 g/L)、25 mL抗壞血酸溶液 (10 g/L)和50 mL甲醇置于容量瓶中，以超純水定容至500 mL，制得混合溶液。

對(duì)照品溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，以甲醇定容配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。其濃度分別為1.06 mg/mL(GA)、0.2 mg/mL(GC)、2.03 mg/mL (EGC)、1.04 mg/mL (+C)、2.02 mg/mL (CAF)、2.03 mg/mL (EGCG)、1.05 mg/mL (EC)、1.00 mg/mL (GCG)、1.99 mg/mL (ECG)。GA、CAF、EGCG、ECG各取0.50 mL，GC、EGC各取2.00 mL，+C、EC各取1.50 mL， GCG取 1.00 mL，各儲(chǔ)備液混合均勻即得10 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 試樣的制備 準(zhǔn)確稱取0.2 g(精確到0.000 1 g)過(guò)40目篩的茶葉粉末置于15 mL離心管中，加入10 mL 70%甲醇，70℃水浴鍋中提取10 min (隔5 min震蕩1次)，于高速離心機(jī)中 (低溫5℃，8 000 r/min)離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶。殘?jiān)儆? mL 70%甲醇重復(fù)提取1次，合并上清液，并用穩(wěn)定溶液定容到25 mL，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

1.2.3 流動(dòng)相的選擇 通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料，梯度洗脫流動(dòng)相主要分為甲醇 (V)∶ 酸溶液 (V)和乙腈(V)∶酸溶液(V)，通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證甲醇 (V)∶ 酸溶液 (V)、乙腈(V)∶酸溶液(V)以及乙腈 (V)∶ 甲醇 (V)∶ 酸溶液 (V)為流動(dòng)相的分離效果，通過(guò)不斷優(yōu)化條件，最終達(dá)到最佳色譜條件。

1.2.4 檢測(cè)方法 色譜柱： Agilent C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)。檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm，流速1 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，在最佳流動(dòng)相及梯度洗脫條件下進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL、100 μL、200 μL、400 μL 和500 μL，用穩(wěn)定液定容到1.00 mL 得一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“1.2.4”檢測(cè)條件下進(jìn)行測(cè)定。以峰面積值(y)對(duì)進(jìn)樣濃度(x)進(jìn)行線性回歸。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 將混合對(duì)照品溶液在最佳流動(dòng)相及梯度洗脫條件下進(jìn)行測(cè)定。連續(xù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10 μL。計(jì)算峰面積RSD值，考察峰面積的一致性。

1.2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn) 稱取0.2 g(精確到0.000 1 g)茶葉粉末于15 mL離心管中，加入2.00 mL的9種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2.2”方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平行進(jìn)行5次樣品測(cè)定，同時(shí)做空白樣品試驗(yàn)，檢測(cè)其本底成分，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.2.8 樣品測(cè)定 取貴州市場(chǎng)上常見的湄潭翠芽、都勻毛尖、云霧毛峰、遵義紅紅茶及紅寶石紅茶5種茶葉，以“1.2.2”進(jìn)行前處理，在最佳流動(dòng)相及梯度洗脫條件下進(jìn)行測(cè)定，3次重復(fù)，檢測(cè)不同茶葉樣品中的兒茶素類和咖啡因含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)表明，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇(V)∶酸溶液(V)時(shí)，色譜圖目標(biāo)峰雖然可以分離，但峰型寬，且有一定的拖尾，影響檢測(cè)靈敏度；當(dāng)流動(dòng)相為乙腈∶酸溶液(V)時(shí)，色譜圖峰型較好，但EGCG和EC的分離效果不佳；最終結(jié)合甲醇和乙腈對(duì)分離度和峰型的特性，通過(guò)不斷優(yōu)化條件，最佳梯度洗脫條件為流動(dòng)相乙腈 (V)∶ 甲醇 (V)∶ 0.5%乙酸 (V)=5∶10∶85，保持5 min；10 min內(nèi)流動(dòng)相改變?yōu)?0∶20∶70；5 min內(nèi)流動(dòng)相改變?yōu)?∶20∶72，并保持2 min；最后3 min內(nèi)改變流動(dòng)相為5∶10∶85，保持1 min，共26 min。從圖1～2可知，在最佳條件下，各目標(biāo)物均有較好的分離度，并和樣品雜質(zhì)有較好的分離效果。

圖1標(biāo)準(zhǔn)溶液中9種化合物的色譜圖

Fig.1 Chromatograms of nine compounds in standard solution

Fig.2 Chromatograms of nine compounds in green tea sample

2.2 線性關(guān)系和線性范圍

從表1可知，GA、GC、EGC、C、CAF、EGCG、EC、GCG和ECG的線性范圍分別為2.6～26.5 μg/mL、2.0～20.0 μg/mL、20.3～203.0 μg/mL、7.8～78.0 μg/mL、5.0～50.5 μg/mL、5.1～50.8 μg/mL、7.9～78.8 μg/mL、5.0～50.0 μg/mL和5.0～49.8 μg/mL；相關(guān)系數(shù)分別為0.999 94、0.999 71、0.999 98、0.999 98、0.999 99、0.999 74、0.999 94、0.999 92和0.999 98；檢出限分別為0.15 μg/mL、2.67 μg/mL、2.70 μg/mL、1.06 μg/mL、0.22 μg/mL、0.67 μg/mL、0.92 μg/mL、0.57 μg/mL和0.66 μg/mL。表明，茶葉中9種化合物在給定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，靈敏度高。

表1茶葉中兒茶素類及咖啡因的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

Table 1 Linear regression equations, correlation coefficients (R2),and limits of detection (LODs) of catechins and caffeine in tea

化合物 Compound線性范圍/ (μg/mL) Linear range線性方程 Linear equation相關(guān)系數(shù)R2Correlation coefficient儀器檢出限/ (μg/mL)LODGA2.6～26.5y=63.684 x-0.2320.999 940.15GC2.0～20.0y=5.631 x-0.7740.999 712.67EGC20.3～203.0y=5.124 x-2.0300.999 982.70+C 7.8～78.0y=12.696 x-1.7950.999 981.06CAF5.0～50.5y=55.207 x-3.5820.999 990.22EGCG5.1～50.8y=26.202 x-12.7560.999 740.67EC7.9～78.8y=12.881 x-0.8550.999 940.92GCG5.0～50.0y=28.001 x-5.5150.999 920.57ECG5.0～49.8y=33.345 x-4.9100.999 980.66

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 重復(fù)性 經(jīng)測(cè)定， GA、GC、EGC、C、CAF、EGCG、EC、GCG和ECG峰面積RSD分別為0.47%、2.12%、0.63%、0.70%、0.48%、1.22%、0.41%、1.36%和0.68%，表明各化合物在最佳色譜條件下檢測(cè)擁有良好的重復(fù)性。

2.3.2 精密度與回收率 由表2可知，該方法測(cè)定茶葉中兒茶素類及咖啡因的平均回收率為94.68%～104.40%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.89%～5.78%，表明該方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

表2 茶葉中兒茶素類及咖啡因的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=5)

2.4 樣品中兒茶素類及咖啡因的含量

從表3可知，5種市售茶葉中，3種綠茶兒茶素類及咖啡因9種化合物均有檢出，但含量存在差異，其中以CAF的含量最高，占9種化合物總含量的32.7%以上；茶多酚以EGCG、EGC、ECG及EC 4種為主，占9種化合物總含量的49.0%以上。2種紅茶僅檢出GA和CAF，其中以CAF的含量最高，占目標(biāo)化合物的93.9%以上。

表3 茶葉樣品中兒茶素類及咖啡因的含量

注：N.D.表示未檢出。

Note: N.D. means non-detected.

3 結(jié)論

在前人的基礎(chǔ)上，研究結(jié)合流動(dòng)相甲醇和乙腈的特性，優(yōu)化了乙腈∶甲醇∶0.5%乙酸溶液的梯度洗脫方法。在Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，乙腈、甲醇、0.5%乙酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫30℃，UV檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm條件下檢測(cè)的各目標(biāo)化合物GA、GC、EGC、C、CAF、EGCG、EC、GCG和ECG峰面積RSD值為0.41%～2.12%。樣品加標(biāo)平均回收率為94.68%～104.40%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.89%～5.78%，表明該方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。在市售5種茶葉中，綠茶中兒茶素類和咖啡因9種化合物均有檢出，但其含量存在差異，這可能與茶葉的老嫩、茶樹品種及制茶工藝的不同有關(guān)[8]；而2種紅茶僅檢出GA和CAF，表明，綠茶中的兒茶素類化合物明顯高于紅茶，說(shuō)明紅茶在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)損失絕大部分茶多酚。該結(jié)論與侯冬巖等[9]研究的一致，未經(jīng)發(fā)酵的生茶和經(jīng)過(guò)渥堆陳化后的發(fā)酵茶中的化學(xué)成分及其含量有著明顯的區(qū)別。而實(shí)際上，茶葉的品種、生長(zhǎng)環(huán)境、放置時(shí)間及加工過(guò)程等，都會(huì)對(duì)茶多酚的含量有著顯著的影響。