荷花B類MADS-box基因家族NnDEF基因的克隆及表達分析

丁獻華，陳 偉，張直峰

(1臨汾職業技術學院經濟管理系，臨汾041000；2山西師范大學生命科學學院，臨汾041000)

花是被子植物獨特的繁殖器官，在已研究的被子植物中超過90%的物種具有典型的完全花結構[1]，即由4輪器官構成，從外到內依次是萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊。花器官早期發育ABC模型是近30年來植物發育生物學最重要的突破之一，通過不同同源異型家族基因互作可以很好地解釋花器官發育特性。具體而言，A類基因調控萼片發育；A類+B類基因協作控制花瓣發育；B類+C類基因協作調控雄蕊發育；C類基因控制雌蕊發育[2]。隨著后來在矮牽牛分離胚珠發育所需的D類基因及擬南芥中分離花瓣、雄蕊和心皮發育所需的E類基因的發現，ABC模型被修正為至今廣泛認可的ABCDE模型。在這些基因中，除了A族基因APETALA2(AP2)屬于AP2ERE基因家族以外[3]，其余基因均屬于MADS-box轉錄因子基因家族[4]。在B族基因中，最經典的包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)APETALA3(AP3)和PISTILLATA(PI)基因，以及金魚草(Antirrhinummajus)DEFICIENS(DEF)和GLOBOSA(GLO)基因，均參與花瓣和雄蕊的器官發育過程[4]。有研究從基部被子植物中克隆和鑒定出與擬南芥同源的A、B、C和E基因，其表達模式基本符合ABCDE模型，但B、C類同源基因表達區域有所外延[5-7]。荷花作為基部被子植物，品種繁多，花器官變異豐富，荷花B類基因如何表達及是否參與花瓣狀器官分化正引發研究者的興趣。目前，有關荷花花發育相關研究多集中在栽培方式、生理生化、組織細胞學、甲基化等方面[8-14]，花發育相關基因(尤其B類基因)功能研究的報道較少。荷花基因組測序已完成[15-16]，大量基因組和轉錄組[17-18]數據的釋放為功能基因的研究提供了很好的平臺。

本研究采用同源基因克隆技術分離荷花(NelumbonuciferaGaertn.)B類AP3DEF-like MADS-box功能基因，并利用生物信息學分析基因及編碼蛋白質的結構特征，實時熒光定量分析基因在不同組織器官中的時空表達模式，探討NnDEF基因在荷花花器官發育及花型形成機制中的作用，以期為今后利用基因工程技術改變荷花花型特征奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以臨汾職業技術學院南湖實訓基地荷花重瓣品種‘重瓣一丈青’(Nelumbonucifera‘chongban yizhangqing’)為材料，于2016年5—6月份取長度約4cm的花苞用于克隆目標基因。為了進一步進行實時定量PCR表達分析，同時采集單瓣品種‘一丈青’(Nelumbonucifera‘yizhangqing’)和重瓣品種‘重瓣一丈青’(Nelumbonucifera‘chongban yizhangqing’)花苞長度為4cm時的根、莖、葉、塊莖、萼片、外側花瓣、內側花瓣、雄蕊和心皮組織。所有樣本采集后液氮速凍，于-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.2 總RNA提取及反轉錄

采用CTAB法提取‘重瓣一丈青’花苞總RNA，使用DNase I(TaKaRa)去除混雜DNA。提取RNA樣品，使用Nanodrop2000c微量紫外分光光度計進行純度和含量測定。使用RevertAidTM first-Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，China)合成cDNA第一鏈，操作按照試劑盒說明書進行。

1.3 基因克隆與序列分析

查找NCBI中EST序列信息,設計NnDEF1和NnDEF2基因引物序列NnDS1FR和NnDS2FR(表1)，以荷花花苞cDNA為模板進行基因全長PCR擴增。反應體系為25 μL，反應條件：95℃ 5 min；95℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃ 5 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的片段，連接pGEM-T載體測序，引物合成和測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 荷花NnDEF1和NnDEF2基因克隆及表達分析所用引物

使用DNAMAN軟件進行序列拼接、核酸及編碼氨基酸預測等分析，獲得的基因序列在NCBI(http：www.ncbi.nlm.nih.gov)網站上進行Blastx比對；使用MEGA 5.0和Clustalx 1.83軟件進行系統進化樹構建。

1.4 基因表達分析

分別提取‘一丈青’和‘重瓣一丈青’的根、莖、葉、塊莖、萼片、外側花瓣、內側花瓣、雄蕊和心皮組織總RNA，反轉錄獲得cDNA(方法同1.2)，使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TaKaRa)和ABI 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems，America)進行Real-time qPCR分析。NnDEF1和NnDEF2基因特異引物序列NnDQ1FR、NnDQ2FR和內參基因Actin基因引物見表1。反應程序為：95℃預變性10 min；95℃ 20 s，68℃ 20 s；40個循環。每個樣品取樣設置3個生物學重復，對每個基因分析進行3次技術重復，采用2-ΔΔCt法進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 基因克隆與氨基酸序列分析

以‘重瓣一丈青’花苞cDNA為模板，分別利用特異引物進行PCR擴增，分離獲得約700 bp的擴增產物，將其連接pGEM-T載體后，進行大腸桿菌轉化，每個基因挑取2個陽性克隆進行測序，獲得2個基因全長cDNA序列。Blastx比對分析表明：所獲片段與植物B功能基因家族AP3DEF亞家族有較高的同源性，證明為所要目的片段，分別命名為NnDEF1和NnDEF2。使用DNAMAN軟件進行序列拼接及分析發現，NnDEF1基因CDS序列全長678 bp，推測編碼225個氨基酸(圖1a)；NnDEF2基因CDS序列全長693 bp，推測編碼230個氨基酸(圖1b)。兩個基因蛋白結構域分析表明：NnDEF1蛋白包含57個MADS-結構域、28個I-結構域、68個K-結構域和72個C-結構域；NnDEF2蛋白包含57個MADS-結構域、28個I-結構域、69個K-結構域和76個C-結構域(圖1)。此外，單、重瓣品種來源的基因編碼區無序列差異。

氨基酸同源序列比對結果表明，NnDEF1和NnDEF2基因編碼的氨基酸序列與其他B類家族AP3DEF亞家族基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性(圖2)。以往研究指出，B類家族功能基因每個進化系均編碼其代表的氨基酸基序。NnDEF1和NnDEF2基因編碼的氨基酸序列C-末端均包含典型的PI衍生基序(FAFHLQPNQLNLQ和FAFHLQSNHPNNLL)和PaleoAP3基序(YGSYDLRLA和YGSHSLRHLS)(圖2)，表明所獲NnDEF1和NnDEF2基因屬于B類PaleoAP3型基因。

基于GenBank數據庫獲得44個B類家族MADS-box基因，用于系統進化樹的構建，以確定荷花NnDEF1和NnDEF2基因的發育位置(圖3)。最大似然法ML(Maximum likelihood)構建系統進化樹結果顯示，PIGLO和AP3DEF同源基因在系統樹中被明顯劃分，NnDEF1和NnDEF2歸于AP3DEF同源基因單元組，與雙子葉植物綱木蘭目馨香木蘭MaodAP3(Magnoliaodoratissima)、山玉蘭MadeAP3(Magnoliadelavayi)、毛茛目三葉木通AktAP3(Akebiarifoliate)、領木春EupAP3(Eupteleapleiosperma)、耬斗菜AqvuAP3-3(Aquilegiavulgaris)、樟目蠟梅ChprAP3(Chimonanthuspraecox)和胡椒目金栗蘭ChspAP3(Chloranthusspicatus)等聚為小支；同時與單子葉植物綱禾本目水稻OsMADS16(Oryzasativa)、微子目香莢蘭VaplDEF(Vanillaplanifolia)、百合目龍舌蘭AgteMADS6(Agavetequilana)等聚為大支，屬于PaleoAP3進化系。

基因序列比對發現，NnDEF1和NnDEF2基因之間CDS區同源性為78.79%，遠高于其他同源基因；氨基酸序列系統進化分析發現，與其他物種的同源蛋白相比，2個基因編碼的蛋白間同樣具有最高同源性(68.15%)和進化相似性，結合二者基因CDS序列高度同源性，推測NnDEF1和NnDEF2基因可能屬于直源基因(圖3)。

2.2 基因表達模式分析

利用Real-time qPCR對NnDEF1和NnDEF2基因在兩種瓣型材料不同組織中的表達進行分析，結果顯示：NnDEF1和NnDEF2基因主要表達在花瓣和雄蕊組織中(圖4)。在單瓣型材料中，NnDEF1基因在雄蕊和內側花瓣組織中高表達，且雄蕊中表達量最高；NnDEF2基因在外側花瓣、內側花瓣和莖組織中高表達，以外側花瓣最高，內側花瓣次之。在重瓣型材料中，NnDEF1基因在雄蕊和內側花瓣組織中高表達，且兩種組織中的表達量相當；NnDEF2基因在外側花瓣、內側花瓣和莖組織中高表達，以外側花瓣最高，內側花瓣與莖組織表達量相當(圖4)。

3 討論

B類MADS-box功能基因在花發育過程中的功能和作用已在多種植物中詳盡報道[19-26]，而其在荷花中的基因特征還不甚了解。荷花屬于蓮科蓮屬多年生水生花卉，具有優良的觀賞、食用和藥用價值。荷花花瓣形態變異豐富，基于花瓣數量可分為單瓣型、半重瓣、重瓣、重臺和千瓣型[27]。荷花原始瓣型為單瓣型，通過雄蕊、 雌蕊的瓣化依次演化出不同重瓣花型。在經典的ABC模型中，B類MADS-box功能基因的主要功能是調控花瓣和雄蕊發育的關鍵調節因子[20，23-24，28]。因此，研究花瓣、雄蕊發育調控基因，對探討荷花花發育及分析荷花瓣化現象的分子機制具有重要意義。

本研究通過RT-PCR技術成功獲得荷花B類MADS-box同源基因NnDEF1和NnDEF2，序列同源性及系統進化樹分析表明，NnDEF1和NnDEF2基因編碼的氨基酸與其他植物的AP3DEF-like基因編碼的氨基酸具有較高的同源性，C-末端包含保守的PI-衍生基序和paleoAP3基序，屬于AP3DEF亞家族paleoAP3進化系，與馨香木蘭MaodAP3、山玉蘭MadeAP3、三葉木通AktAP3、領木春EupAP3、蠟梅ChprAP3和金栗蘭ChspAP3等聚為一類，這些均屬于基部雙子葉植物。該結果與APG III系統相一致，說明AP3DEF-like基因在進化上相對保守，同時也例證了荷花歸屬于基部被子植物[29]。

關鍵調控基因的復增及其功能趨異是形態多樣性和進化的重要途徑[30-31]。NnDEF1和NnDEF2基因CDS序列同源性(78.8%)和氨基酸同源性(68.2%)均遠高于其他物種同源基因，表明二者可能屬于直源基因。這種同源基因CDS序列同源性高于氨基酸序列同源性的現象，也是基因加倍后趨異進化的常見現象。這些結果表明，荷花AP3DEF-like基因可能存在基因加倍現象，而這種基因加倍后趨異進化現象則可能是荷花出現復雜花型變異的原因。

基因表達分析表明，NnDEF1和NnDEF2基因的表達既具有品種間的相似性,也具有同一個體內的差異性。在兩種花型荷花材料中，NnDEF1基因傾向于在花瓣和雄蕊組織中表達，這與經典的ABC模型中B類基因表達模式相符合[32-34]；而NnDEF2基因表達更廣泛，除了在莖、花瓣和雄蕊組織中高表達外，在根、葉、萼片、心皮中均有表達，推測是由于B類基因復增后產生與其表達模式相一致的新功能，如蘭花AP3DEF直系同源基因OMADS3影響分生組織發育[31]及大丁草(Gerberaanandria)GDEF1和GDEF2基因對葉、苞葉、花莖、花及根等器官發育的影響[25，35]。此外，本研究發現,NnDEF1基因的表達部位更靠近花器官內側，包括內側花瓣和雄蕊組織；而NnDEF2基因的表達則更靠近外側組織，包括外側花瓣和內側花瓣組織。這種表達趨勢表明NnDEF1和NnDEF2基因在調控荷花花瓣發育過程中存在功能異化，相對而言NnDEF1基因在調控內側花瓣和雄蕊發育中的作用較大，而NnDEF2基因則主要調控外側組織。比較單瓣型和重瓣型荷花材料可以發現，二者的基因表達模式差異主要為NnDEF1基因。單瓣型材料中NnDEF1基因在雄蕊組織中的表達量明顯高于內側花瓣，而在重瓣型材料兩個組織中的表達量相當。這表明在常規單瓣型材料中主要在雄蕊中表達的NnDEF1基因在重瓣型材料內側花瓣組織出現提高表達，這與已知的荷花重瓣花的形成途徑主要是雄蕊瓣化的結論相一致。這些結果表明，NnDEF1基因在荷花瓣化發育過程中可能發揮重要作用，其調控方式需要進一步深入研究。