高效液相色譜法測定葛仙米水溶性多糖含量

蘇攀峰，唐慶九，陳 盛，趙立彬，王玉蘭，劉艷芳，周 帥*，許劍鋒

(1上海市農業科學院食用菌研究所，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，國家食用菌加工技術研發分中心，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，上海 201403；2上海海洋大學食品學院,上海 201306；3上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306；4湖南炎帝生物工程有限公司，株洲 412000)

葛仙米(Nostocsphaeroidskützing)在我國歷史悠久，是一種藥食同源的植物[1]，屬于藍藻門念珠藻科[2-4]。葛仙米的營養成分豐富，蛋白質、氨基酸、VC、VE和β-胡蘿卜素含量高，同時還富含具有生物活性的多糖[5]。研究發現葛仙米多糖由葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸等多種單糖組成，具有抗腫瘤、抗凝血與抗菌等作用[6-8]。

蒽酮比色法和苯酚-硫酸法是多糖含量測定的常用方法[9]，測定結果為多糖的總量，而HPLC法[10-11]可以分析特定分子量多糖的含量，更好地表征葛仙米多糖的特性。前期研究發現葛仙米多糖的HPLC分子量分布圖譜中主要為大分子量多糖，且該多糖部分沒有蛋白和核酸的吸收，因此可以運用HPLC對葛仙米中大分子量多糖進行定量分析。本研究采用高效液相色譜方法，用示差折光檢測器和多角度激光光散射檢測器，0.2molL的鹽溶液做流動相，以分離純化的葛仙米多糖為標準品，建立一套高效液相色譜快速、準確直接測定葛仙米中大分子量多糖含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛仙米由湖南炎帝生物工程有限公司提供，海藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸標準物質購于美國Sigma公司，三氟乙酸(TFA)購于Merck公司，重蒸酚、濃硫酸、氫氧化鈉等均為國藥集團化學試劑有限公司生產的分析純。

AG 22331高速離心機(Eppendorf公司)；FA2004N分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；HWS12型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；DC-2006低溫恒溫槽(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；冷凍干燥機(Thermo Savant公司)；Waters2695型高效液相色譜儀及Empower色譜工作站及數據處理系統(美國 Waters 公司)；ELGA PURELAB Ultra 超純水儀(威立雅水處理技術有限公司)；小型粉碎機(上海淀九中藥機械制造有限公司)；ICS-2500型高效離子色譜儀(Dionex公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準品的制備

取葛仙米粉末于容量瓶中，加入500倍體積的蒸餾水，100℃水浴2h，離心(9 000g，15min)，上清液濃縮至原體積的110，加入無水乙醇醇沉，使乙醇體積濃度達到40%，4℃過夜，離心收集沉淀，用體積濃度為45%乙醇醇洗4次；將醇洗后的沉淀溶解在10倍體積的蒸餾水中，加入無水乙醇醇沉，使乙醇體積濃度達到40%，4℃過夜，離心收集沉淀，用體積濃度為45%乙醇醇洗2次；冷凍干燥獲得大分子葛仙米多糖純品，經苯酚-硫酸法[12-13]檢測多糖含量為97.9%，HPLC檢測為均一對稱峰，因此可作為葛仙米多糖標準品。精密取葛仙米多糖標準品100 mg于10 mL容量瓶中，加入超純水溶解定容，搖勻待用。

1.2.2 柱型的選擇

稱取標準品3.0 mg，加入1 mL流動相，充分溶解，離心，上清液經0.22 μm的水相微孔膜過濾后進行HPSEC-MALLS-RI分析，選擇TSKgel G6000 PWXL、TSKgel G6000 PWXL與TSKgel G4000 PWXL串聯進行比較，選擇合適的柱型。

1.2.3 多糖含量測定

將經過預處理的葛仙米多糖提取液按標準溶液的測定條件測出峰面積。根據線性方程和以下公式算出葛仙米多糖的含量。

(1)

其中，D為根據線性方程算出葛仙米多糖的質量體積比(mgmL)，M是原料質量體積比(mgmL)。

色譜條件[14-15]：Waters 2695 HPLC 系統配備UV檢測器、示差折光檢測器(RI)、多角度激光光散射檢測器(MALLS)，TSKgel G6000 PWXL、TSKgel G4000 PWXL(7.8 mm×30 cm)，流動相為0.15 molL NaNO3、0.05 molL NaH2PO4(pH=7、0.02%的N3Na)，柱溫30 ℃，流速0.5 mLmin，使用Astra(version 6.1.1，Wyatt Technology，Santa Barbara，CA)數據分析軟件對光散射數據進行采集和分析，折光指數增量dndc=0.146 mLg。

1.2.4 葛仙米水溶性多糖提取條件的單因素試驗

1.2.4.1 加熱時間的選擇

1.2.4.2 加熱溫度的選擇

1.2.4.3 料液比的選擇

1.2.5 葛仙米水溶性多糖提取條件的正交試驗

為確定提取葛仙米水溶性多糖的最優提取條件，在單因素試驗的基礎上，選取料液比、提取時間、提取溫度進行了3因素3水平正交試驗，采用L9(34)正交表(表1)。

表1 正交試驗因素水平

正交試驗的驗證試驗：準確稱取葛仙米各 100.0 mg置于具塞三角瓶中，按照‘1.2.5’試驗所確定的最優提取工藝進行試驗，按‘1.2.3’的方法計算多糖含量。

1.2.6 方法學考察

1.2.6.1 精密度考察

1.2.6.2 重現性考察

1.2.6.3 穩定性考察

1.2.6.4 加樣回收率考察

1.3 統計分析

所有單因素試驗重復3次，結果為其平均值。對結果進行方差分析，P≤0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 葛仙米多糖的HPLC圖譜及其標準曲線

分別對不同的多糖色譜柱進行比較分析，發現TSK-Gel G6000 PWXL分離效果較好，用該色譜條件的葛仙米多糖標準品和葛仙米的HPLC如圖1所示，樣品的色譜峰與其他成分有效分離，該峰在波長280 nm和260 nm基本無紫外吸收，因此該出峰時間段沒有蛋白和核酸的干擾，可以進行多糖的HPLC分析定量。

以醇沉的葛仙米多糖為標準品，在0.015 625—5.0 mgmL內，峰面積與進樣量作標準曲線得到線性方程Y=1 995 695.548X-170.597(R2=0.999)，標準曲線呈良好線性關系，定量上限為10 mgmL、下限為0.078 625 mgmL。

2.2 葛仙米多糖提取條件的單因素結果分析

葛仙米多糖如何能被充分提取出來，對影響因素進行分析的結果如圖2。隨著加熱時間的增加，多糖含量逐漸升高，大于5h以后無顯著差異。溫度對多糖的提取影響較大，溫度越高，多糖含量增加；因此最適合的溫度為100℃。料液比為1∶50—1∶500時，多糖含量隨著料液比的增加而提高，因此選擇料液比為1∶500。

2.3 葛仙米水溶性多糖正交試驗結果

表2中的極差值大小可以看出，RA>RB>RC，影響因素的順序為溫度>時間>料液比。由均值大小可知，最優試驗方案為：溫度100 ℃、時間5 h、料液比為1∶500。在 A3B3C2條件下進行葛仙米水溶性多糖提取的驗證試驗，多糖含量為47.01%，接近于表2正交試驗結果47.68%，可驗證采用正交試驗法優化葛仙米水溶性多糖的提取工藝是可行的。

表2 正交試驗結果

2.4 方法學考察結果

2.4.1 精密度、重現性、穩定性考察

按照‘1.2.6.1—1.2.6.3’進行試驗，表3結果表明：儀器精密度良好；重現性和穩定性的RSD值分別為1.13%、2.56%，HPLC測定方法的重現性和穩定性良好，符合試驗要求。

表3 精密度、重現性、顯色穩定性的考察結果

2.4.3 加樣回收率考察

如表4所示，較小的RSD值顯示試驗數據的可信度較大；加樣回收率均超過96%，表明加樣回收率高，測定值能夠反映實際值。

表4 加樣回收率結果

3 結論

HPLC法測定葛仙米多糖與苯酚硫酸法相比，優勢在于可以測定特定分子量范圍的多糖。該方法可以在大分子量多糖無蛋白和核酸干擾的情況下使用，能更加準確地定量。HPLC法測定大分子量多糖和苯酚硫酸法測定總糖這兩種方法進行結合可以更好地表征葛仙米多糖的特征。

按照優化條件對葛仙米水溶性多糖進行水提，采用苯酚-硫酸法測得的總糖為32.6%，從測定結果來看，采用HPLC法測定葛仙米多糖含量更高，為47%左右。這兩個結果比較矛盾，分析其原因，主要是由于苯酚硫酸法測定所用的標準品為葡萄糖，而葛仙米多糖的單糖組成有甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和葡萄糖醛酸，同樣濃度時半乳糖、葡萄糖醛酸會比葡萄糖的吸光度低，導致多糖含量被低估。根據甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸其物質的量的比(1.00∶1.92∶0.97∶1.02∶0.91)配制混合標準品，再進行測定，運用優化的方法進行提取分析，發現葛仙米多糖含量為48.13%。這個方法的多糖測定也發現葛仙米中主要含有的是大分量多糖。

因此，運用HPLC測定葛仙米水溶性多糖含量的方法學考察結果表明，該方法精密度高、重復性和穩定性好，適用于葛仙米水溶性多糖含量的測定分析，為葛仙米水溶性多糖含量的測定提供了可靠的方法和手段。