張海恩 何玉英 李 健 胡 碩 韓 旭
密度脅迫對中國對蝦幼蝦生長、抗氧化系統功能及水質指標的影響*
張海恩1,3何玉英2,3①李 健2,3胡 碩1,3韓 旭1,3
(1. 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306;2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071;3. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海水養殖病害防治重點實驗室 青島 266071)
通過室內40 d養殖實驗,研究了4個養殖密度G0(250尾/m3)、G1(500尾/m3)、G2(1000尾/m3)、G3(2000尾/m3)對體重為0.08 g的中國對蝦()幼蝦生長、抗氧化系統功能及水質指標的影響。研究表明,密度脅迫20 d時,G1、G2生長和成活率與G0差異不顯著(0.05),G3顯著低于G0(<0.05);脅迫40 d時,G1生長和成活率顯著低于G0(<0.05),G2生長顯著低于G0(<0.05),G2成活率與G0差異極顯著(<0.01),G3生長和成活率均與G0差異極顯著(<0.01)。通過檢測血淋巴、肝胰腺、鰓和肌肉組織中抗氧化系統指標發現,中國對蝦的總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)隨密度增加呈先升高后降低的趨勢:20 d時,4種酶的活性在G1和G2中顯著高于G0(<0.05);40 d時,則顯著降低(<0.05)。中國對蝦中丙二醛(MDA)含量隨密度的增加呈上升趨勢,G3的MDA含量始終顯著高于G0(<0.05);G1、G2的MDA含量僅在40 d肝胰腺中顯著高于G0(<0.05),其他組織內均差異不顯著(0.05)。不同養殖密度對主要水質指標pH、DO、NO2-N、NO3-N、NH3-N和COD無顯著影響(0.05),均在中國對蝦生長的適宜范圍內。本研究表明,密度脅迫顯著影響中國對蝦的生長及抗氧化能力,養殖20 d時的適宜密度為1000尾/m3,40 d時的適宜密度為250尾/m3。
中國對蝦;密度;生長;抗氧化酶;水質
中國對蝦為我國近海特有的品種,主要分布在黃海、渤海和朝鮮西部沿海,是我國海水養殖的主要種類(Deng, 1990; 林群等, 2018)。為了滿足人們的需求,水產養殖業的規?;杆侔l展,高密度養殖成為提高對蝦養殖產量、降低養殖成本的重要途徑。然而,隨著密度增加,種群個體之間對資源和空間的競爭將導致動物在生長、能量、生理及免疫功能等一系列變化,最終可能會導致動物生存能力降低(Piekcing, 1989)。中國對蝦缺乏獲得性免疫系統,它主要依靠各種類型的非特異性免疫因子來抵抗外部環境脅迫和各種病原感染,抗氧化系統在消除環境脅迫產生的過量活性氧(ROS)方面起著重要作用。
鄧勇輝等(2001)采用大棚溫室將羅氏沼蝦()幼蝦暫養30 d左右再移于外塘養成,認為中間暫養能夠有限提高對蝦的生長和成活率。張嘉萌等(1989)和Li等(2006)雖然報道了密度脅迫對中國對蝦生長性狀的影響,但對于中國對蝦幼蝦在小水體(中間暫養)條件下的生長規律及合適的養殖密度的相關研究較少。
作者研究了密度脅迫對中國對蝦生長、抗氧化系統功能及水質指標的影響,以期為進一步研究中國對蝦在不同密度脅迫下的適應機制提供參考,并為中國對蝦的養殖提供相應的技術支撐。
健康中國對蝦于2018年5月取于山東昌邑市海豐水產養殖有限責任公司,育苗后暫養,用隨機抽樣的方法挑選健壯無病、平均體長為(2.0±0.1) cm、平均體重為(0.08±0.01) g的蝦苗,暫養于32 cm×38 cm×50 cm的水箱,實驗用水為過濾凈化后的天然海水,鹽度為33.47,水溫為24.1℃,pH為8.19,溶解氧為6.62 mg/L。
根據前期預實驗結果(張天時等, 2008),共設置4個密度組,記為G0(對照組)、G1、G2和G3,分別對應實驗密度12、25、50、100尾/箱,相當于中國對蝦養殖密度為250、500、1000、2000尾/m3,每組設置 3個平行。整個實驗周期為40 d,24 h持續充氧,每天飼料投喂活鹵蟲,投喂量為中國對蝦體重的8%,分 4次投喂(08:00、12:00、16:00和22:00),每天換水1/3。養殖過程中及時將死亡的中國對蝦撈出,并通過調整實驗水體的大小來保持實驗密度。每10 d測1次水質及體長和體重,記錄每個實驗組的死亡個數,統計死亡率,分別在實驗前、養殖20 d和結束時取樣。
1.3.1 樣品的采集 用1 ml一次性注射器吸取在4℃預冷的抗凝劑0.5 ml,從對蝦的圍心腔抽取0.5 ml的血淋巴液,混合均勻后加入無RNA酶的1.5 ml離心管中,4500 r/min離心15 min,取上清液,置于80℃冰箱保存;鰓、肝胰腺、肌肉組織樣品分別取0.2 g,肝胰腺、鰓,剪碎,加入1∶9的預冷生理鹽水,超聲波冰浴破碎組織,4℃下4000 r/min離心20 min后,取上清液置于-80℃冰箱保存,用于組織酶活測定。
1.3.2 生長指標的測定
增重率(WGR, %)=100×(2–1)/1;
相對增長率(AGR, %/d)=100×(2–1)/d;
特定生長率(SGR, %/d)=100×(ln2–ln1)/d;
體重差異系數(CV, %)=100×體重標準差/平均體重;
成活率(SR, %)=100×N/1
式中,1,2分別為各測量階段的初始體重和末體重,1,2分別為實驗初始尾數和結束尾數,d為養殖天數。
1.3.3 抗氧化指標的測定 總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)指標,均采用上海酶聯生物科技有限公司生產的試劑盒測定,測定方法參照說明書進行。
1.3.4 水質的測量 溫度、鹽度、pH和DO含量借助于YSI 556型水質分析儀測定。采用次溴酸鹽氧化法測定氨氮,萘乙二胺分光光度法測定亞硝酸鹽氮,鋅鎘還原法測定硝酸氮,高錳酸鉀分光光度法測定化學需氧量。
實驗數據用平均值±標準誤(Mean±SE)表示,數據分析采用SPSS17.0單因素方差分析(One-way ANOVA)進行處理,以0.05為差異顯著,以0.01為差異極顯著,用Origin軟件作圖。
由圖1可見,養殖密度對中國對蝦體長、體重的影響存在顯著差異(<0.05),隨養殖密度的增加而降低。養殖10 d時,體長和體重在4個密度中無顯著差異(>0.05);20 d時,G3顯著低于G0(<0.05),G1和G2差異不顯著(>0.05);30 d時,G1、G2和G3均顯著低于G0(<0.05);40 d時,G3的體長和體重與對照組差異極顯著(<0.01),G1和G2與對照組差異顯著(<0.05)。
通過對實驗過程中養殖成活率的統計(表1)可以看出,中國對蝦的成活率隨著養殖密度的增加而降低。養殖10 d時,存活率在4個密度中差異不顯著(>0.05);20 d時,G3顯著低于G0組(<0.05),G1和G2與對照組差異不顯著(>0.05);30 d時,G3成活率下降為65%,與對照組差異極顯著(<0.01),G1和G2差異顯著(<0.05);40 d時,G2和G3成活率均達極顯著水平(<0.01),分別下降為60%和55%,G1達顯著水平(<0.05),由對照組的85%下降為74%。

圖1 密度脅迫在各養殖階段對中國對蝦體長和體重的影響
G0~G3分別為250、500、1000和2000尾/m3
G0~G3 are 250, 500, 1000, and 2000 ind./m3respectively
*表示同一時間實驗組與對照組差異顯著(<0.05);**表示同一時間實驗組與對照組差異極顯著(<0.01),下同
*indicated significant difference (<0.05); ** indicated highly significant difference (<0.01). The same as below
表1 密度脅迫在各養殖階段對中國對蝦成活率的影響

Tab.1 Effects of density stress on survival rate of F. chinensis during different culture stages
注:*表示同一時間實驗組與對照組差異顯著(< 0.05);**表示同一時間實驗組與對照組差異極顯著(< 0.01),下同
Note: *indicated significant difference (<0.05); ** indicated highly significant difference (<0.01). The same as below
表2密度脅迫下養殖40d時對中國對蝦生長指標的影響

Tab.2 Effects of density stress on growth indicators of F. chinensis for 40 days
養殖40 d后(表2),中國對蝦的增重率、相對增長率和特定生長率均隨養殖密度的增加而降低,體重差異系數隨養殖密度增加而增加。G3的各項生長指標與對照組相比,均達極顯著水平(<0.01),G1和G2差異顯著(<0.05),說明養殖密度的增加嚴重影響了中國對蝦的生長。
2.2.1 密度脅迫對中國對蝦T-AOC的影響 從圖2可以看出,中國對蝦體內T-AOC活力為肝胰腺>肌肉>血淋巴>鰓,各組織T-AOC活力隨密度增加整體呈先升高后降低的趨勢,最后活力均低于對照組。G1和G2在20 d時,血淋巴、肝胰腺組織T-AOC活性升高達最高值,顯著高于G0(<0.05);40 d時,G1與G0差異不顯著(>0.05),G2顯著低于G0(< 0.05)。隨著密度的增加,G3在血淋巴、肝胰腺組織T-AOC活性始終低于G0,差異極顯著(<0.01);鰓和肌肉組織中T-AOC活性無顯著性差異(>0.05)。
2.2.2 密度脅迫對中國對蝦SOD的影響 從圖3可以看出,中國對蝦體內SOD活力為肌肉>肝胰腺>血淋巴>鰓,SOD活力隨密度增加整體呈先上升后下降的趨勢,最后活力均低于對照組。G1和G2在20 d時SOD活性升高,G1在鰓和肌肉組織、G2在4種組織中SOD活力均顯著高于G0(<0.05)。40 d時,SOD活性降低,G1與G0差異不顯著(>0.05),G2顯著低于G0(<0.05);G3在4種組織T-AOC活力始終低于G0,差異極顯著(<0.01)。
2.2.3 密度脅迫對中國對蝦CAT的影響 從圖4可以看出,中國對蝦體內CAT活力為肝胰腺>血淋巴>肌肉>鰓,CAT活力隨密度增加整體呈先上升后下降的趨勢。20 d時,G1、G2和G3在血淋巴、鰓和肝胰腺中CAT活力均顯著高于G0(<0.05),G3在肝胰腺中差異極顯著(<0.01);40 d時,CAT活力下降,G2和G3在3種組織中的CAT活力顯著低于G0(< 0.05)。肌肉的不同密度組之間差異不明顯(>0.05)。
2.2.4 密度脅迫對中國對蝦GPx的影響 從圖5可以看出,中國對蝦體內GPx活力為肝胰腺>鰓>血淋巴>肌肉,GPx活力隨著密度的增加整體呈先上升后下降的趨勢。20 d時,GPx活力升高:G1在鰓中顯著高于G0(<0.05),G2在肝胰腺中顯著高于G0(<0.05),其余均差異不顯著(>0.05);40 d時,GPx活力下降,G2在肝胰腺中顯著低于G0(<0.05)。G3在血淋巴、鰓、肝胰腺組織中GPx活力始終低于G0,差異顯著(<0.05)。肌肉GPx活性在不同密度組之間無顯著差異(>0.05)。

圖2 中國對蝦不同組織總抗氧化能力(T-AOC)隨密度脅迫時間的變化

圖3 中國對蝦不同組織SOD活性隨密度脅迫時間的變化

圖4 中國對蝦不同組織CAT活性隨密度脅迫時間的變化

圖5 中國對蝦不同組織GPx活性隨密度脅迫時間的變化
2.2.5 密度脅迫對中國對蝦MDA的影響 從圖6可以看出,中國對蝦體內MDA含量為肝胰腺>血淋巴>鰓>肌肉,密度越大,MDA含量越高,均高于對照組。20 d時,G1和G2各組織內MDA含量與G0差異不顯著(>0.05);40 d,時MDA含量升高,G1在肝胰腺中顯著高于G0(>0.05),G2在血淋巴和肝胰腺中均顯著高于G0(<0.05);G3在血淋巴和肝胰腺MDA含量隨養殖時間逐漸升高,20 d、40 d始終高于G0(<0.05);鰓、肌肉組織的MDA含量變化不明顯,與G0差異不顯著(>0.05)。
表3記錄了實驗期間水質因子的變動,水溫隨季節變化整體呈上升趨勢,鹽度變化較穩定,在32.05~ 34.22范圍內,溶解氧(DO)的質量濃度為5.98~ 6.82 mg/L,pH隨密度增加整體是下降的趨勢,亞硝態氮(NO2-N)、硝態氮(NO3-N)、氨態氮(NH3-N)和化學需氧量(COD)隨密度增加整體呈上升趨勢,統計分析表明,不同實驗組之間差異不顯著(>0.05),均處于中國對蝦生長安全閾值內(李旭光等, 2004)。
密度影響對蝦生長和死亡率的機制有不同的解釋,Ray等(1992)認為,高密度通過引起水質惡化,產生更多氨氮等毒性物質,造成水體環境質量下降,從而影響對蝦的生長和存活。本研究中,理化因子及NO2-N、NO3-N、NH3-N和COD等水質因子均在對蝦生長的安全范圍內,說明水質并不是影響對蝦生長及成活率的主要原因,而是養殖密度過大導致的種內對生存空間和領地的競爭,能量消耗程度不同,進而影響對蝦生長等,與楊國梁(2008)、Tseng(1998)和Nga(2005)等的研究結果一致。劉國興等(2014)對克氏原螯蝦()的研究結果表明,高密度養殖會使對蝦殘肢率升高,生長指標及存活率下降。本研究表明,養殖40 d后,中國對蝦隨密度增大,其增重率、相對增長率、特定生長率逐漸下降,與Marques等(2000)對凡納濱對蝦() 的研究結果一致。同時還發現,中國對蝦的體重差異數隨密度增大而上升,密度越高,對蝦個體間差異趨于增大,說明密度對對蝦體重增量均一性也有顯著影響(張天時等, 2008)。另外,本研究發現,在養殖20 d過程中,在密度250(G0)~1000尾/m3(G2)范圍內,中國對蝦幼蝦體長、體重和成活率未發現顯著差異,Marques等(2000)也有相似結論,0.05 g羅氏沼蝦在暫養60 d后,100~800尾/m2密度間成活率無顯著差異,采用800尾/m2密度養殖成本最低。因此,推測不同規格的對蝦在不同階段都有一個對空間的利用率最高的密度范圍,所以,確定最適宜的密度可降低對蝦的養殖成本。本研究中,0.08 g中國對蝦養殖 20 d時的最大適宜密度為1000尾/m3(G2)。

圖6 中國對蝦不同組織MDA活性隨密度脅迫時間的變化
表3 實驗期間水質因子的變動

Tab.3 Variations of water quality parameters during the experiment
在環境脅迫條件下,機體會產生大量的活性氧如超氧陰離子自由基(O2-·)、羥自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)等,對其生理機能和免疫功能造成損害(Duan, 2013)。適量的活性氧對機體具有一定的保護作用,但活性氧過量可導致氧化脅迫(喬順風等, 2006),機體通過抗氧化系統發揮作用,將過量的活性氧清除,保護各組織免受氧化損傷(Mathew, 2007)。其中,T-AOC能夠反映機體自由基的代謝狀態和抗氧化系統的工作能力,有很強的代表性,因此,可以作為反映體內組織抗氧化功能的一個良好指標(Lewis, 1996),并且SOD能將超氧陰離子轉變為H2O2,進而阻止活性氧、自由基對機體的直接傷害,然后,機體通過CAT途徑(催化H2O2生成H2O和O2)和GPx途徑(催化H2O2生成H2O)進一步清除有毒的H2O2(Fridovich, 1989),而MDA是脂類過氧化作用的最終分解產物,可以反映機體脂質過氧化的程度,間接地反映出細胞損傷的程度(彭士明等, 2010)。
本研究中,密度脅迫20 d后,T-AOC、SOD和GPx活力的變化趨勢大體一致,隨密度的增加先升高后下降,CAT活力隨密度增加而升高。G1和G2密度組在20 d時,T-AOC、SOD、GPx和CAT活力均顯著高于對照組,表明在此階段密度脅迫下,抗氧化酶活性受到誘導而升高,可以看出4種抗氧化酶在共同發揮作用,從而消除過量H2O2和活性氧,與彭士明等(2010)對銀鯧()幼魚的研究結論相似,并且此時MDA含量與G0差異不顯著,間接體現了對蝦機體未受到損傷;而G3組在20 d時,T-AOC、SOD和GPx活力顯著低于對照組,同時,MDA含量顯著高于對照組,說明密度過高,造成蝦體內自由基增加太多,超出了其清除能力,使抗氧化系統酶活力受到抑制,但CAT還處在工作狀態,繼續發揮作用,活力高于對照組,推測在GPx在受到抑制后,CAT繼續清除多余活性氧,GPx和CAT在清除自由基過程中發揮著相互補充的作用(Wang, 2008),結合此時G1、G2和G3對蝦的成活率,表明養殖20 d時,G3超出了對蝦承受的密度范圍,G1和G2為中國對蝦適宜密度。
隨著密度脅迫時間的延長,中國對蝦幼蝦的規格不斷增大,空間會越來越限制對蝦的生長,抗氧化系統也會發生變化。密度脅迫40 d時,只有G0的抗氧化能力處于穩定狀態,G1、G2和G3的T-AOC、SOD、GPx和CAT酶活力隨密度增加基本處于下降趨勢,G1和G2酶活力未恢復到對照水平,3組密度活力均顯著低于對照組,可能由于密度引起對蝦個體斗爭加劇,高密度養殖導致了蝦體內抗氧化系統紊亂,無法恢復到原態,與Kommaly(2016)和陳勇(2016)等研究密度脅迫對T-AOC、SOD和CAT的影響變化規律一致。在亓成龍(2016)研究中,團頭魴幼魚的血清和肝臟的MDA含量隨著養殖密度的升高發生了顯著性上升。本研究中,G1、G2和G3組MDA含量在40 d時急劇升高,均高于對照組,表明密度越大,會更早引起膜質過氧化,導致機體損害更嚴重(Winston, 1991),能夠反映對蝦受密度脅迫的程度,表明養殖40 d時,只有G0處于中國對蝦的適宜密度。
本研究發現,密度脅迫對中國對蝦抗氧化酶活力存在組織差異性,對血淋巴、鰓、肝胰腺和肌肉4種組織T-AOC、GPx、CAT、SOD和MDA的變化有不同程度的影響。在密度脅迫下,肝胰腺中5種酶活力較血淋巴、鰓和肌肉3個組織變化最顯著,其中,肌肉組織的T-AOC、CAT、GPx、MDA和鰓組織的T-AOC、MDA變化在各密度間差異不顯著,這可能與組織的功能定位有關。肝胰腺是蝦類消化和代謝中心,其組織內抗氧化酶活性處于較高水平,能夠清除多余活性氧(段亞飛等, 2015),但長時間的密度脅迫會對其抗氧化系統造成損傷。因此,可以檢測肝胰腺組織T-AOC、GPx、CAT、SOD和MDA的變化,作為密度脅迫抗氧化的監測指標。
適宜的飼養密度應該是充分考慮到投放規格的大小,最大限度地發揮其生長潛能、提高其成活率的飼養密度(陳勇, 2016)。本研究表明,中國對蝦幼蝦初始體重為0.08 g養殖20 d時,適宜養殖密度應該為1000尾/m3(G3),此時養殖密度在這個水平時中國對蝦的體長、體重及成活率(86%)和機體的抗氧化系統功能均較高,與250尾/m3(G0)差異不顯著;中國對蝦幼蝦初始體重為0.08 g,養殖周期為40 d時,建議250尾/m3作為適宜的養殖密度,生長指標及抗氧化系統功能最高。另外,Forster等(1974)研究了0.1 g中國對蝦養殖密度為25和166尾/m2,養殖112 d,平均成活率達到67%和41%,可能養殖周期的不同,造成了成活率之間的差異,所以,隨養殖周期長短及對蝦規格的大小,及時調整中國對蝦密度,可以有效降低成本、增加效益。
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Effects of Stocking Density on Growth, Water Quality, and Antioxidant System of Juvenile
ZHANG Hai’en1,3, HE Yuying2,3①, LI Jian2,3, HU Shuo1,3, Han Xu1,3
(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306; 2. Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao 266071; 3. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071)
This study analyzed the effective growth, non-specific immune function, and water quality required for juvenile shrimps of(initial weight, 0.08 g) at four stocking densities of G0 (250 ind./m3), G1 (500 ind./m3), G2 (1000 ind./m3), and G3 (2000 ind./m3) during a 40-d indoor culture experiment. The results showed that the survival rate and growth index of G1 and G2 at 20 d were not significantly different from those of G0 (>0.05), while the survival rate and growth index of G3 was significantly lower than those of G0 (<0.05). At 40 d, the growth index and survival rate of G1 was significantly lower than G0 (<0.05) The growth index of G2 was significantly lower than G0 (<0.05), while G2 the survival rate was extremely significant different from G0 (<0.01). And the growth index and survival rate of G3 was extremely significant different from G0 (<0.01). Measurement of the antioxidant status in the serum, hepatopancreas, gill, and muscle tissue showed that the total antioxidative capacity, superoxide dismutase, hydrogen peroxide, and glutathione peroxidase first increased and then decreased with increase in density. At 20 d, the four oxidation indices were significantly higher in G1 and G2 than in G0 (<0.05), and at 40 d, the indices were significantly lower than those in G0 (<0.05). The content of malondialdehyde (MDA) increased gradually with increase in density; the MDA of G3 was always significantly higher than that of G0 (<0.05). The MDA of G1 and G2 was significantly higher than that of G0 in hepatopancreatic tissue at 40 d (<0.05), and was not significantly different from that in the other tissues (>0.05). The pH, DO, NO2-N, NO3-N, NH3-N, and COD had no significant effect on the main water quality indices (>0.05) at different densities, which were all within the suitable range for the growth of. The results showed that density stress significantly affects the growth and antioxidant capacity of,and the suitable densities were 1000 ind./m3for 20 d and 250 ind./m3for 40 d.
; Stocking density; Growth; Antioxidant enzymes; Water quality
S917
A
2095-9869(2020)02-0140-10
何玉英,研究員,E-mail: heyy@ysfri.ac.cn
2019-01-22,
2019-02-19
*現代農業產業技術體系(CARS-48)、山東省泰山產業領軍人才工程項目(LNJY2015002)、國家自然科學基金(31772842)和中國水產科學研究院院級基本科研業務費(2016HY-JC0302)共同資助[This work was supported by China Aquaculture Research System (CARS-48), Program of Shandong Province Leading Talent (LNJY2015002), National Natural Science Foundation of China (31772842), and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2016HY-JC0302)]. 張海恩,E-mail: 18804895712@163.com
10.19663/j.issn2095-9869.20190122001
http://www.yykxjz.cn/
張海恩, 何玉英, 李健, 胡碩, 韓旭. 密度脅迫對中國對蝦幼蝦生長、抗氧化系統功能及水質指標的影響. 漁業科學進展, 2020, 41(2): 140–149
Zhang HE, He YY, Li J, Hu S, Han X. Effects of stocking density on growth, water quality, and antioxidant system of juvenile. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 140–149
HE Yuying, E-mail:heyy@ysfri.ac.cn
(編輯 馬璀艷)