血管內皮生長因子在藏羊脾臟中的表達分布研究

周熳琳，董珮玲，韓禹婷，陸弈橙，楊 琨,2,3

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030;2.西北民族大學 生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030;3.西北民族大學 生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

藏羊（Tibetan sheep）別稱為藏系羊，是我國三大原始綿羊品種之一[1]。藏羊因其耐高寒，耐干旱而喜濕冷等習性而合適高寒牧區的生活，相比于其他品種更加適合低氧環境而成為西北牧民的主要飼養畜種。本實驗依據藏羊的自身耐高寒和缺氧的特點開展研究。

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF），又稱為血管通透因子（vascular permeability factor,VPF）是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，當前VEGF家族有7個，分別是VEGF-A、VEGFB、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F及胎盤生長因子(placenta growth factor,PIGF)[2,3]。血管內皮生長因子在促進血管通透性的增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等方面具有重要作用。一般在正常機體內血管的形成和抑制是處于平衡狀態，新生的血管受到嚴格的控制，大量的血管生成可出現于胚胎發生、損傷修復等時期[4]。VEGF的作用調控機制如下：作為一種強大的血管直接誘導因子，可誘導血管內皮細胞的增殖，通過細胞小囊泡器來實現增加血管通透性，使得血管成分泄漏，為血管內皮細胞的遷移及血管形成提供條件。這種特異性有絲分裂元，不僅在體內可以誘導血管的增生，還可以促進細胞的增殖。在低氧條件的處理下，VEGF蛋白可以與內皮細胞的VEGF受體結合，誘導受體的自身磷酸化，從而激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），實現VEGF的有絲分裂原特性，誘導內皮細胞的增生。而且有大量研究表明血管內皮生長因子不僅參與調控內皮細胞的增殖，對于非內皮細胞的增殖分化也有一定的影響，就比如說VEGF受低氧誘導因子的調控，在低氧條件下可以刺激血管平滑肌細胞不斷增殖并大量分泌低氧誘導因子，而低氧誘導因子可以使VEGF的mRNA和蛋白以及VEGF受體的mRNA表達水平增高[5,6]。當Folkman提出“實體惡性腫瘤的生長和轉移離不開新生血管”的觀點之后，就有大量研究發現，在低氧環境的條件下，可以促進血管內皮生長因子在細胞間的過量表達，而過量表達與腫瘤血管的形成有密切的關系[7]。由于血管內皮生長因子和血管內皮生長因子受體2構成信號通路是作用最強的正性調控通路之一，對血管新生的整個過程的調節起到了無法替代的作用，這也就導致人們對于血管內皮生長因子的研究愈發向腫瘤方向靠攏[8]。

本實驗欲通過免疫組織化學方法來初步分析VEGF在1歲藏羊脾臟中的表達分布以及探討VEGF因子在藏羊適應高寒低氧環境的調控機制，為高原低氧研究提供形態學研究資料[4]。

1 材料與方法

1.1 材料的采集

本實驗所采用的組織均為1歲健康藏羊的脾臟，所有的健康組織都在甘肅省蘭州市某屠宰場采集。在藏羊放血后15 min內立即采集脾臟組織并用4%的多聚甲醛固定。

1.2 材料的處理

按照石蠟包埋的常規方法先將藏羊脾臟組織切成長寬均為1 cm左右，厚度不超過5 mm的小塊進行包埋，再將包埋好的蠟塊進行修塊和切片（厚度一般為4～5 um），最后使用HE染色方法以及免疫組織化學染色技術對制成的切片進行染色處理。

1.3 實驗所需試劑

本實驗用到的試劑包括兔VEGF多克隆抗體（bs-1665R）、免疫組織化學檢測試劑盒（SP-0023）以及AEC水溶性顯色試劑盒，所需試劑均從北京博奧森生物技術有限公司買入。

1.4 HE染色及免疫組織化學方法檢測

將制成的切片先進行HE染色觀察藏羊脾臟的組織結構的完整性及其結構特點，然后采用免疫組織化學染色方法對切片進行檢測，所有步驟根據HE染色常規方法和免疫組織化學檢測試劑盒的說明書中的操作順序進行。

1.5 實驗結果的判定

本實驗將經過AEC水溶性顯色試劑盒染色的藏羊脾臟組織切片的染色結果進行對比，根據染色結果中脾臟組織的染色深淺以及染色面積來判定VEGF在藏羊脾臟組織中的表達強弱。

2 結果與分析

2.1 藏羊脾臟的組織學結構

觀察圖1（A,B）可知藏羊脾臟的結構組織完整，各個部位發育狀況良好，沒有發現病變部位。并且切片中可觀察到藏羊脾臟的實質部分的組織分布明顯，較易區分。其中白髓中的中央動脈容易辨認，有明顯的分層，由里及外可分為內膜層、中膜層以及外膜層。血管內膜層襯于血管腔面組成內膜層，由平滑肌構成中膜層，結締組織組成外膜層。

圖1 藏羊脾臟組織切片HE染色法觀察結果

2.2 免疫組織化學法檢測藏羊脾臟中VEGF蛋白的表達

由免疫組織化學方法染色的結果圖2（A,B）可見藏羊脾臟的白髓、紅髓，被膜以及小梁等組織都有VEGF蛋白的表達。但仔細觀察染色結果可發現VEGF呈強陽性表達于藏羊脾臟白髓的中央動脈內膜血管內皮細胞和外膜層的纖維細胞，紅髓中脾血竇的內皮細胞；小梁和被膜上呈現弱陽性表達，而在中央動脈中膜層平滑肌中基本無表達。

圖2 藏羊脾臟組織切片免疫組織化學檢測結果

3 討論

藏羊作為高原寒冷特殊的生態環境中典型動物代表，具有一定的高原低氧適應性[9,10]。脾臟是主要的外周免疫器官在免疫應答中起到了無法替代的作用，而脾臟功能的實現更是依賴于其特殊的血液微循環系統[11-13]。有研究表明VEGF對脾臟切除手術后自體移植脾臟組織再生血管的形成有促進作用，可以改善脾臟組織的血液循環，促使被移植脾臟組織的再生，可以有效縮短脾臟形態結構完善的時間以及促進脾臟發揮免疫作用等功能[14]。

VEGF作為特異性的有絲分裂元對新生血管的過程起著無法替代的調控作用，在正常氧濃度中起著維持血管平衡的作用且表達量較少，但因為低氧作用是影響VEGF表達的主要因素，在此條件下VEGF的表達會顯著增加。實驗結果中也可發現在藏羊脾臟的內皮細胞中有大量的表達，可驗證在低氧環境會促進VEGF與內皮細胞上的特異性受體相結合，達到刺激內皮細胞增殖的目的。

有研究發現VEGF可在脾臟邊緣區的淋巴細胞以及白髓的淋巴組織中檢測，并且發現外源性的VEGF對自體移植的脾臟組織不僅對血管的再生有促進作用，還可以促進細胞的增生，結構的恢復以及局部形成良好的血供[15-17]。更有低氧對VEGF表達的促進作用都可以說明本實驗的研究結果VEGF會表達于藏羊脾臟白髓中的各種淋巴細胞和中央動脈的血管內皮細胞以及外膜層，紅髓中的血竇以及邊緣區的淋巴組織。這說明VEGF在藏羊脾臟組織的形態結構和功能的維持中起著不可替代的作用。