侵染貴州火龍果的仙人指X病毒的基因組序列變異

鄭乾明， 王小柯， 馬玉華

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院 果樹科學研究所， 貴州 貴陽 550006)

火龍果又稱紅龍果或仙蜜果，為仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)的多年生果樹。當前在我國南方和西南地區(qū)種植，常使用成熟莖進行營養(yǎng)繁殖，導致病毒積累。仙人掌X病毒(CactusvirusX，CVX)、蟹爪蘭X病毒(ZygocactusvirusX，ZyVX)和仙人指X病毒(SchlumbergeravirusX，SchVX)等侵染火龍果后會產(chǎn)生局部壞死、黃化和褪綠等癥狀，在我國臺灣[1-2]、海南[3-4]等省及巴西[5]、韓國[6]和美國[7]等國家均有報道。

CVX、ZyVX和SchVX均為正義單鏈RNA病毒，屬甲型線形病毒科(Alphaflexiviridae)馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)[5]。CVX(Genbank登錄號：AF308158)基因組全長約6.6 kb，5′端含帽子結構，3′端含poly A序列[2]，含有5個開放讀碼框(Open Reading Frame，ORF)，分別為依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)、TGB(Triple gene block)蛋白1～3和外殼蛋白(Coat protein，CP)。ZyVX的B1分離物(Genbank登錄號：AY366208)分離自蟹爪蘭[8]，P39分離物(Genbank登錄號：JF930326)分離自火龍果，其基因組均具有上述類似結構。目前從仙人掌科仙人指屬(Schlumbergera)[8]和胭脂掌屬(Opuntia)[9-10]寄主分離SchVX基因組全長，從錦繡玉屬(Parodia)寄主分離CP序列(Genbank登錄號：KY581588)[11]，從巴西火龍果分離RdRp部分序列(Genbank登錄號：EU670721)[5]。課題組近年來對采自貴州省的疑似病毒感染火龍果樣品開展相關研究，鄭乾明等[12-13]利用高通量測序結合PCR擴增，獲得CVX-NTU等貴州分離物基因組序列，并分析其遺傳變異。目前從我國種植的火龍果中分離SchVX并研究其遺傳變異的報道鮮見。為研究侵染火龍果的仙人指X病毒SchVX)發(fā)生情況和遺傳變異，筆者等利用基于Illumina平臺的高通量測序對6份疑似病毒感染貴州火龍果樣品進行分析，以了解SchVX發(fā)生情況，獲得SchVX貴州分離物的相關序列，分析其遺傳變異，以期為后續(xù)病毒分子檢測與防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品：2017年8月在貴州省羅甸縣和鎮(zhèn)寧縣的火龍果果園(品種均為紫紅龍)，采集莖表面有褪綠、黃化斑點等疑似病毒病表現(xiàn)的樣品6份(LR、ZNF、ZYP、RF、ZNS、LW)，置于冰盒中帶回實驗室，使用無菌水清洗莖表面并擦干，切取感病組織液氮速凍，-80℃保存待用。

主要試劑：Trizol試劑購自Invitrogen公司；去真核生物核糖體RNA試劑Ribo-ZeroTMrRNA Removal Kit購自Epicentre公司。

1.2 方法

1.2.1 高通量測序 利用Trizol試劑提取6份樣品的總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光分光光度計檢測質量與濃度。后續(xù)高通量測序和數(shù)據(jù)分析委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。合格樣品使用Ribo-ZeroTMrRNA Removal Kit去除核糖體RNA，剩余RNA打斷成短片段。使用隨機引物合成第1條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第2條cDNA鏈。經(jīng)過純化、洗脫、末端修復、連Poly(A)、連測序接頭及片段大小篩選，最后進行PCR擴增。測序文庫使用Illumina HiSeq 4000進行測序，測序策略為PE150。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 測序獲得的raw read進行質量控制，過濾低質量的read，產(chǎn)生的clean read利用Trinity v 2.1.1進行組裝。獲得的contig序列在NCBI非冗余核酸和蛋白質數(shù)據(jù)庫中分別使用BLASTn和BLASTx進行檢索和注釋。

1.2.3 序列分析 使用ORF Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找contig序列中的ORF。與參考基因組序列的一致性比對使用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)工具在線比對。使用Lasergene計算核苷酸和推導的氨基酸序列一致性。核苷酸和推導的氨基酸序列使用Clustal W程序進行序列比對，比對結果用MEGA 7.0構建基于鄰接法的系統(tǒng)進化樹，Bootstrap值計算進行1 000次重復。

2 結果與分析

2.1 SchVX相關序列

對6份樣品獲得的clean read分別進行組裝，獲得大量contig序列。通過在NCBI中進行BLASTn和BLASTx檢索，篩選出SchVX相關的contig序列結果(表1)，6份樣品中SchVX相關contig數(shù)量為18～52條。樣品LR中SchVX相關的clean read數(shù)量最少，僅3 269條，占該樣品中所有clean read數(shù)量的0.003%。其余5份樣品中，SchVX相關clean read數(shù)量為3 540 797～17 792 691條。樣品LW中SchVX相關的clean read數(shù)量最多，達17 792 691條，占該樣品中所有clean read數(shù)量的17.5%。

表1火龍果樣品的SchVX相關clean read和contig序列

Table 1 SchVX-related clean read and contigs from six pitaya samples

樣品SampleContig數(shù)量/條Contig numberClean read 數(shù)量/條占比/% LR413 2690.003 ZNF233 540 7973.7 ZYP528 391 0676.3 RF409 570 6297.8 ZNS2811 004 0939.9 LW1817 792 69117.5

注：占比指占該樣品中所有clean read數(shù)量的百分比。

Note:Proportion means percentage of all clean read number in each sample.

2.2 SchVX相關序列與參考基因組的差異

參試樣品中的SchVX相關contig序列與參考基因組SchVX-Palma-PE(Genbank登錄號：KP090203)進行序列比對和一致性計算的結果(表2)顯示，6份樣品中，contig長度最短為201bp，最長為5 617 bp。每份樣品中的contig序列均覆蓋99.2%～99.6%的參考基因組，說明6份樣品獲得的SchVX相關contig序列基本覆蓋完整的參考基因組。ZYP樣品中的contig序列與參考基因組序列的一致性為82.8%～100.0%，其他5份樣品的序列一致性為85.9%～96.7%。

表2 SchVX貴州分離物相關contig與參考基因組序列比對

2.3 CP序列差異

從表3看出，SchVX貴州分離物CP的核苷酸序列和推導的氨基酸序列一致性分別為92.5%～97.3%和96.0%～99.1%。與NI分離物(Genbank登錄號：KY581588)序列一致性分別為93.7%～95.1%和97.3%～98.2%，與K11分離物(Genbank登錄號：AY366207)序列一致性分別為93.5%～95.0%和95.1%～96.9%，與Palma-PE分離物序列一致性分別為92.9%～95.6%和96.9%～98.2%，與nopal verdure 1分離物(Genbank登錄號：KU854929)序列一致性分別為87.3%～88.5%和95.6%～97.3%。

表3 SchVX貴州分離物CP序列與其他分離物序列的一致性

2.4 基于CP序列的系統(tǒng)進化

利用SchVX貴州分離物CP序列和NI等6個分離物，以及侵染火龍果的PiVX、CVX、ZyVX、CVX-NTU等CP序列共同構建的系統(tǒng)進化樹(圖1)顯示，外類群OpVX單獨為一類，SchVX各分離物均聚為一類，與PiVX、CVX、ZyVX和CVX-NTU明顯分開。

基于核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹(圖1A)表明，SchVX-LW、SchVX-RF、SchVX-ZNF、SchVX-ZNS、SchVX-ZYP與Palma-PE分離物親緣關系較近，SchVX-LR與SchVX-LW、SchVX-RF、SchVX-ZNF、SchVX-ZNS、SchVX-ZYP、Palma-PE、K11和NI分離物的親緣關系較遠。基于推導的氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹(圖1B)表明，6個SchVX貴州分離物與NI和Palma-PE分離物親緣關系較近，與K11分離物親緣關系較遠，與nopal verdure 1分離物親緣關系最遠。

3 結論與討論

基于Illumina平臺的高通量測序技術具有深度高、準確率高、讀長較短的特點，廣泛用于果樹作物病毒挖掘和鑒定[14]。筆者等對貴州2個火龍果主產(chǎn)縣果園采集的6份疑似病毒侵染樣品進行高通量測序，獲得并統(tǒng)計SchVX序列。在5份樣品中檢測到大量SchVX相關序列，其含量占總read數(shù)量的3.7%～17.5%，說明采樣地點的火龍果受SchVX侵染的比例較高。

對6份樣品獲得的SchVX序列單獨組裝，產(chǎn)生的contig序列基本覆蓋完整的參考基因組序列，為了解SchVX基因組分子變異提供了基礎。6份樣品中SchVX相關contig序列與參考基因組相比，序列一致性最低為82.8%，最高為100.0%，多為85.9%～96.7%。與前期分離自貴州火龍果的CVX-NTU和ZyVX的遺傳變異相比[12-13]，SchVX的序列一致性水平略低，說明存在一定程度的遺傳變異。

注：A為基于CP核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹，B為基于推導的CP氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹。

Note: A,Phylogenetic tree based on CP nucleotide sequence; B,Phylogenetic tree based on deduced CP amino acid sequence.

圖1SchVX貴州分離物與其他病毒的系統(tǒng)進化樹

Fig.1 Phylogenetic trees of SchVX Guizhou isolates and other viruses

馬鈴薯X病毒屬病毒的CP序列編碼外殼蛋白，在包裝病毒核酸物質和病毒胞間移動的過程中發(fā)揮重要功能[15]。侵染火龍果的SchVX貴州分離物的CP核苷酸和推導的氨基酸序列一致性分別為92.5%～97.3%和96.0%～99.1%，與來源于仙人指K11分離物[8]、胭脂掌Palma-PE分離物[9]和金晃NI分離物[11]序列一致性較接近，明顯高于來自梨果仙人掌nopal verdure 1分離物。系統(tǒng)進化分析也表明，nopal verdure 1分離物與上述分離物的親緣關系較遠。CHEN等[16]研究表明，病毒的變異主要是由病毒與寄主之間的互作關系所決定。當前來源于仙人掌科各類寄主的SchVX分離物表現(xiàn)不同程度的變異，可能與其侵染的寄主種類有關。

綜上所述，樣品采集地的火龍果普遍受SchVX侵染，其基因組序列存在一定程度的遺傳變異。研究獲得的序列未完全覆蓋完整的SchVX基因組，采集的樣品數(shù)量也不夠豐富。在未來的研究中需要進一步獲得SchVX基因組全長序列，同時增加樣品采集數(shù)量，以更準確分析侵染火龍果的SchVX群體的遺傳變異情況，為其檢測和防控提供理論基礎。