CEMP1基因修飾骨質疏松大鼠BMSCs與β－TCP體外復合培養實驗

江俊 吳玉銘 何夢嬌 鄭寶玉 許雄程 李艷芬 陳玉玲 駱凱*

1．福建醫科大學附屬口腔醫院，福建福州350002

2．中國科學技術大學附屬第一醫院安徽省立醫院，安徽合肥230000

3．福建醫科大學口腔醫學研究院，福建福州350002

4．溫州醫科大學附屬口腔醫院，浙江溫州325027

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨代謝疾病，以骨結構異常、骨脆性增高和骨量減少為主要臨床表現，易出現骨折，嚴重影響中老年人的生活質量。更年期婦女隨著體內雌激素水平的下降，骨量迅速丟失，易出現絕經后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis，PMO)［1］。研究顯示［2－3］PMO 與牙周炎存在明顯相關性，可加速牙周組織的破壞。如何實現PMO狀態下的牙周組織再生是當前牙周病臨床治療所面臨的眾多挑戰之一。近年來，組織工程技術與基因工程技術的聯合應用為實現牙周組織的修復再生提供了新的思路。牙骨質蛋白1(cementum protein 1，CEMP1)作為牙骨質特異性蛋白之一，可促進非礦化細胞向成骨細胞分化，有望應用于牙周組織的再生［4］。因此，本研究擬通過構建人CEMP1基因重組慢病毒過表達載體，并轉染PMO大鼠骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)，使CEMP1在PMO大鼠BMSCs中穩定表達，同時將過表達CEMP1的BMSCs與β磷酸三鈣(β－tricalcium phosphate，β－TCP)復合培養，觀察細胞的生長情況，為后續利用CEMP1實現骨質疏松狀態下的牙周組織再生奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:3月齡 SPF級Sprague－Dawley(SD)雌性大鼠，體重280～300 g，動物許可證號:SCXK(滬)2012－0002。按嚙齒類動物標準飼養于南京軍區福州總醫院比較醫學科，適應性喂養1周后開始實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器:DMEM低糖培養基、胎牛血清(Hyclone，美國);0.25%胰蛋白酶(Gibico BRL，美國);重組慢病毒 LV－CEMP1－EGFP(本實驗室保存);抗壞血酸、β－磷酸甘油、地塞米松和茜素紅(Sigma，美國);堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、堿性磷酸酶檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);Prime ScriptTMRT Reagent Kit和 SYBR Primix Ex TaqTM試劑盒(Takara，日本);Trizol試劑盒(Invitrogen，美國);β－TCP(上海貝奧路生物材料有限公司);CEMP1多克隆抗體(Abcam公司);生物安全柜(力申科學儀器有限公司，上海);細胞培養箱(Heraeus，德國);iMARK 酶標儀(Bio－Rad，美國);實時熒光定量PCR儀(Roche LightCycler 480，德國);相差熒光顯微鏡(Olympus，日本);電泳裝置(Bio－Rad，美國);掃描電鏡 (FEI Nova Nano SEM230，美國)。

1.2 方法

1.2.1 PMO大鼠BMSCs的獲取及體外培養:參照課題組前期方法［5］建立骨質疏松大鼠模型，模型建立成功后將大鼠經麻醉頸椎脫臼處死。無菌條件下取出大鼠雙側股骨和脛骨，剪去骨端兩側，采用細胞培養液反復沖洗骨髓腔，直到骨頭發白為止。將獲取的細胞懸液經1 000 r/min，離心5 min，棄上清，DMEM低糖培養液(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L，10%FBS)重懸，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中。第3天首次半量換液，之后按常規進行換液。待細胞密度達到80%～90%時進行消化傳代，實驗選擇P3以內細胞進行。

1.2.2 PMO大鼠BMSCs體外成骨分化能力檢測:PMO大鼠BMSCs以每孔1×105個接種于6孔板，以成骨誘導液(基礎培養液中加入50 μg/mL維生素C、10 mmol/L β－磷酸甘油、10 nmol/L 地塞米松)進行培養，每3天換液。誘導7 d后收集細胞進行ALP染色，誘導21 d后進行礦化結節茜素紅染色。

1.2.3 PMO大鼠BMSCs基因轉染檢測:將PMO大鼠BMSCs以1×104/cm2密度進行接種，待細胞生長至約70%融合時參照課題組前期方法［6］進行目的基因轉染。實驗分組如下:轉染組(LV－CEMP1－EGFP)、空載體組 (LV－EGFP)和空白對照組(BC)。目的基因轉染后通過倒置熒光顯微鏡對轉染細胞進行觀察，采用流式細胞儀檢測細胞的轉染效率，通過實時熒光定量PCR及免疫細胞化學染色檢測CEMP1的表達情況。實時熒光定量PCR反應引物序列見表1。

表1 PCR反應引物序列及產物大小Table 1 Specific primers of PCR and product size

1.2.4 基因轉染PMO大鼠BMSCs與β－TCP復合培養:β－TCP預濕后置于37℃培養箱中備用，將LV－CEMP1－EGFP轉染的PMO大鼠 BMSCs消化后，調整細胞密度至1×107個/mL接種于β－TCP表面，每平方厘米接種50 μL。37°C培養箱中靜置2 h后緩慢加入培養液，24 h后進行倒置熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察。

2 結果

2.1 PMO大鼠BMSCs原代培養及成骨分化能力檢測

BMSCs原代培養3 d時，鏡下仍有較多的紅細胞存在，也可見到少量梭形貼壁細胞。隨著時間的延長，細胞呈集落樣生長，形態表現為紡錘形或多角形。培養10 d左右，細胞即可達到80%～90%，可進行傳代(圖1a)。成骨誘導液培養7 d時細胞ALP染色呈棕黑色(圖1b)，成骨誘導液培養21 d時即可觀察到茜素紅染色呈橘紅色的礦化結節(圖1c)。

圖1PMO大鼠BMSCs體外培養及成骨分化檢測(×100)a:原代培養的BMSCs;b:ALP染色;c:鈣結節茜素紅染色。Fig．1 Morphological observation and osteogenic differentiation of PMO rat BMSCs(×100)

2.2 CEMP1基因轉染PMO大鼠BMSCs檢測

PMO大鼠BMSCs經慢病毒轉染24 h即可觀察到綠色熒光，隨著時間的增加，細胞熒光逐漸加強，細胞形態未出現明顯的改變，BC組未見熒光表達(圖2)。通過流式細胞儀檢測發現，轉染72 h后LV－CEMP1－EGFP組熒光表達率為86.9%，見圖2e。

2.3 基因轉染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1基因表達檢測

實時熒光定量PCR結果顯示CEMP1基因轉染PMO大鼠 BMSCs后，僅 LV－CEMP1－EGFP組有CEMP1基因的擴增曲線，而LV－EGFP組和BC組均未見該基因擴增曲線(圖3)。

圖2 LV－CEMP1－EGFP轉染PMO大鼠BMSCs檢測(×100)a＆b:LV－CEMP1－EGFP 組;c＆d:BC 組;e:LVCEMP1－EGFP組轉染率。Fig．2 Detection of PMO rat BMSCs after LV－CEMP1－EGFP transfection(×100)

圖3PMO大鼠BMSCs中CEMP1 mRNA的表達 a:GAPDH擴增曲線;b:LV－CEMP1－EGFP轉染組目的基因擴增曲線;c:空載體LV－EGFP轉染組;d:BC組。Fig．3 Detection of CEMP1mRNA expression by Real time PCR

2.4 基因轉染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白表達檢測

Western Blot檢測結果顯示，LV－EGFP組和BC組均未見CEMP1蛋白表達，僅LV－CEMP1－EGFP組可檢測到CEMP1蛋白的表達(圖4)。免疫細胞化學染色結果顯示，LV－CEMP1－EGFP組細胞可見明顯棕色染色(圖5a)，而LV－EGFP組和BC組細胞均未見明顯著色(圖5b～圖5c)。

2.5 基因轉染PMO大鼠BMSCs與β－TCP復合培養

轉染LV－CEMP1－EGFP的 PMO大鼠 BMSCs與β－TCP復合培養24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察可見有綠色熒光的細胞附著于β－TCP的不同層面(圖6a、圖6b)，在掃描電鏡下觀察可見材料表面細胞充分伸展，狀態較好(圖6c)。

圖4 轉染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白的表達1:BC組;2:空載體 LV－EGFP轉染組;3:LV－CEMP1－EGFP轉染組。Fig．4 Western Blot of CEMP1 protein expression in PMO rat BMSCs after gene transfection

圖5 轉染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白免疫細胞化學染色(×100)a:LV－CEMP1－EGFP轉染組;b:空載體LV－EGFP轉染組;c:BC組。Fig．5 Immunohistochemical staining of CEMP1 protein expression in PMO rat BMSCs after gene transfection(×100)

圖6 基因轉染PMO大鼠BMSCs與β－TCP復合培養(×100)a＆b:LV－CEMP1－EGFP 轉染細胞與 β－TCP復合培養倒置熒光顯微鏡觀察;c:LV－CEMP1－EGFP轉染細胞與β－TCP復合培養掃描電鏡觀察;d:β－TCP掃描電鏡觀察。Fig．6 Co－ culture of PMO rat BMSCs with β － TCP after gene transfection(×100)

3 討論

BMSCs具有多向分化能力，且取材相對容易，常用于組織工程技術和基因治療中，可實現牙周組織的修復再生［7－9］。但現有的研究［10］認為 PMO 患者的BMSCs更易于向脂肪細胞分化，成脂能力更高，而細胞的成骨分化能力相應的有所減弱。動物實驗［11］也證實與假手術組相比，PMO大鼠BMSCs的增殖與遷移能力顯著降低，細胞的凋亡活性增加。因此，如何提升PMO狀態下BMSCs的成骨分化能力是學者們亟待解決的問題。

CEMP1是從成牙骨質細胞瘤中發現的一種牙骨質特異性蛋白［12］，可促進牙周膜細胞向成牙骨質表型分化，促進牙骨質的再生［13－15］。轉染 CEMP1基因的人牙齦成纖維細胞的成骨及成牙骨質相關基因表達增高，堿性磷酸酶活性增強，礦化結節形成能力得到顯著提升［16］。上述研究提示，CEMP1可提高細胞的成骨分化能力，有望應用于牙周組織再生研究。因此本研究利用慢病毒載體將CEMP1轉染至PMO大鼠BMSCs，結果顯示轉染細胞高表達CEMP1，這為后續探討CEMP1基因修飾PMO大鼠BMSCs實現牙周組織再生研究創造了條件。

β－TCP屬于人工合成材料，可作為組織工程支架材料構建工程化復合物，實現骨組織再生［17］。研究［18］發現將重組人骨形成蛋白－2復合于β－TCP后植入兔肌肉內8周，即可觀察到明顯的新生骨樣組織。課題組以往研究［19］成功將犬頜骨骨膜細胞與β－TCP復合培養構建組織工程復合物，實現犬的牙周組織再生。因此，本研究選擇多孔β－TCP作為種子細胞的支架材料。研究結果顯示CEMP1基因修飾的PMO大鼠BMSCs在β－TCP上生長良好，形態正常，細胞間連接緊密，提示β－TCP對細胞的生長沒有影響，生物相容性較好。

牙周炎與OP同為中老年人的常見病、多發病。如何實現OP患者牙周組織的再生是當前牙周臨床醫生所關注的重點。基因工程技術和組織工程技術的聯合應用使理想的牙周組織再生成為可能。本實驗首次以OP狀態的BMSC為靶細胞轉染CEMP1并與β－TCP復合，構建CEMP1修改的工程化復合物。結果顯示，PMO大鼠BMSCs轉染LV－CEMP1－EGFP后能穩定高效表達CEMP1，且在β－TCP表面及內部附著并生長良好，分泌胞外基質。表明在本實驗條件下可成功構建以 β－TCP為支架的CEMP1基因修飾的工程化復合物，但該復合物的體內成骨能力及能否實現OP狀態下牙周組織再生仍需后續進一步的研究探討。