高糖環境LIF介導STAT3/SOCS3信號通路參與成骨細胞分化機制研究

劉長路 馬麗波 劉曉民 黃健

內蒙古醫科大學第二附屬醫院，內蒙呼和浩特010030

隨著經濟發展、科技進步和人民生活水平的不斷提高，我國人口老齡化、勞動強度及飲食結構的改變日益明顯，糖尿病發病率逐年上升，糖尿病患者骨折后出現骨延遲愈合或骨不連顯著增多，治療和康復比較困難，致殘、致死率極高，影響人們的生活質量。不僅增加醫療支出，更給患者家庭和社會造成了沉重的負擔［1－3］。尋找治療糖尿病骨折延遲愈合的有效方法意義重大。骨折后在神經體液調節下成骨細胞被激活，激活后的成骨細胞在骨轉化代謝過程中，通常會產生一些代謝產物－成骨分化標志物，臨床上常以檢測ALP、RUNX2、OCN和OPN作為反映成骨細胞功能的指標［4］。

白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)屬于白介素 6(interleukin－6，IL－6)家族中的多向性細胞因子，在多種組織中廣泛表達，這個家族多數成員可以通過激活信號轉導和轉錄激活因子(signal transducers and activator of transcription，STAT)來影響細胞增殖、轉錄等活性［5］。JAK/STAT信號通路［6］通常為細胞外配體與跨膜細胞因子受體結合，激活蛋白酪氨酸激酶，活化后使受體發生磷酸化，STAT可以識別磷酸化的受體，然后STAT亦發生磷酸化，磷酸化后形成二聚體進入胞核，成為有活性的轉錄因子，進而影響相關基因的表達。細胞因子信號傳導抑制蛋白(suppressors of cytokine signaling，SOCS)［7］是新近發現的一類細胞因子信號傳導過程中的負性調控因子，SOCS的特點是STAT信號通路可以激活前者的基因表達，而前者又可以抑制后者的繼續活化，從而提供一個負反饋回路，參與多種細胞因子、激素和生長因子的信號調節過程。本研究將探討STAT3/SOCS3信號通路在LIF介導的高糖環境下成骨細胞分化調節中的作用機制，為進一步明確高糖導致的成骨障礙提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標本:本研究收集了2017年1月至2018年12月在內蒙古醫科大學第二附屬醫院就診的2型糖尿病骨折患者和同期正常骨折患者各50例。入院后第二天晨起空腹取受試者靜脈血5 mL進行實驗分析，4℃放置4 h，分離出血清，離心后保存在－80℃，避免反復冷凍和解凍。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.1.2 成骨細胞:人成骨細胞MG－63購自美國細胞培養公司(ATCC，Manassas，VA，USA)，培養于 DMEM和EMEM培養基。培養基購自Gibco公司(GIBCO，Rockville，MD，USA)，添加1%非必須氨基酸(NEAA)(Sigma－Aldrich Corporation，St．Louis，MO，USA)、2 mmol/L 谷氨酰胺(Ameresco，Framingham，MA，USA)和10% 胎牛血清(FBS，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，于37℃、5%CO2培養箱中培養。經過高糖及LIF處理后的MG－63細胞用0.1%PBS沖洗，種植于含2%胎牛血清的DMEM/EMEM培養液中，培養基中添加 0、10、30、60 mg/mL 的高糖(Sigma－Aldrich，St．Louis，MO，USA)和 0、20、50、100 ng/mL 重組人 LIF 蛋白(Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)，37 ℃、5%CO2孵育0、0.5、1、2、4、6 和12 h 后分別添加50 nmol/L的STAT3抑制劑葫蘆素水合物JSI－124(Sigma－Aldrich Corporation，St．Louis，MO，USA)到細胞上清液。

1.2 方法

1.2.1 酶聯免疫吸附法檢測細胞因子:嚴格按照ELISA 試劑盒(Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)說明步驟檢測各種細胞因子:超敏C反應蛋白(hsCRP)、白介素 1β(IL－1β)、白介素6(IL－6)和 LIF的水平。先用 2%BSA預沖洗(Ameresco，Framingham，MA，USA)，4℃過夜，加入一系列稀釋的樣本或血清/上清液樣本室溫下孵育2 h，然后加入抗hsCRP、IL－1β、IL－6和LIF 的辣根過氧化物酶結合多克隆抗體溶液，室溫孵育40 min后，加入底物溶液室溫孵育20 min，450 nm處進行光密度測定，每次孵育前均用PBS沖洗，一共沖洗4次。

1.2.2 實時熒光定量基因表達分析:實時熒光定量RT－PCR反應檢測成骨細胞被干擾后ALP、RUNX2、OCN和OPN的mRNA變化。具體步驟:TRIzol提取劑(Sigma－Aldrich Corporation，St．Louis，MO，USA)提取 RNA，滴加 1 μL SUPERase·InTMRNase 抑制劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，利用 OD260/OD280比定量檢測。每份RNA樣本的定量檢測采用One Step RT－PCR 試劑盒(Tak Kala biological，Tokyo，Japan)，首先進行反轉錄(42 ℃，5 min，5 ℃，10 s)，然后利用ABI PRISM 7900HT序列檢測系統(Thermo Scientific，Rockford，USA)進行PCR反應(95℃反應5 s，60℃反應20 s，40個循環)，利用溶解曲線分析特異性的擴增產物，利用2－ΔΔCt方法檢測 mRNA，其結果采用與磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)相對值表示，引物鏈(PCR引物由上海生工有限公司設計合成)見表1。

1.2.3 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達:細胞核和胞漿蛋白利用NE－PERTM細胞核和細胞漿提取試劑(Sigma－Aldrich Corporation，St．Louis，MO，USA)提取，全部實驗操作參照說明書，其定量采用BCA蛋白測定試劑盒測定(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，采用12%SDS－PAGE分離相同量的(30 μg)樣本繼而將分離蛋白通過電泳轉移到硝酸纖維素膜上(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，2%胎牛血清蛋白BSA(Sigma－Aldrich Corporation，St．Louis，MO，USA)溶于PBS中4℃ 過夜，封膜，室溫下孵育2 h后與特異性 STAT3/SOCS3GAPDH(Abcam biotechnology，St．Louis，Cambridge，UK)抗體結合，然后將膜用辣根過氧化物酶抗兔抗體在室溫下孵育1 h，最后用增強化學免疫熒光儀檢測，采用Gel－Pro分析軟件4.0分析每個目標泳道的分光度，結果用與GAPDH相對光密度的比值表示。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 統計學處理

實驗結果用均數±標準差表示，采用單因素方差分析及配對資料t檢驗進行統計學比較，數據使用SPSS 22.0統計軟件進行處理，所有實驗均獨立操作重復3次，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料

納入病例的臨床特點見表2。

2.2 正常人群和2型糖尿病患者血清LIF含量的比較

正常人群和2型糖尿病患者血清中超敏C－反應蛋白(hsCRP)、白介素 1β(IL－1β)、白介素 6(IL－6)和白血病抑制因子(LIF)水平比較，糖尿病患者hsCRP水平明顯高于正常組(P＜0.05，圖1 A)，IL－1β和IL－6水平也明顯升高(P＜0.05，圖1B和圖1C)，糖尿病患者 LIF水平明顯升高(P＜0.05，圖1D)，證實2型糖尿病患者中LIF及其他促炎細胞因子表達增加。

表2 兩組一般資料比較Table 2 Comparison of basic data between the two groups

圖1 ELISA檢測正常人群和2型糖尿病患者血清標本炎性因子及LIF含量的比較Fig．1 The serum levels of inflammatory factors and LIF in normal controls and diabetes mellitus patients detected by ELISA

2.3 高糖及LIF對成骨分化標志物表達的影響

為了探討高糖及LIF對成骨細胞分化的調節作用，用ELISA法檢測不同濃度的高糖及LIF干預MG－63后成骨分化標志物 ALP、RUNX2、OCN和OPN的表達情況。高糖(15、50、150 mg/mL)或LIF(20、50、100 ng/mL)干預 MG－63 細胞，隨著其濃度的增加，ALP的表達逐漸減低(P＜0.05)，呈劑量依賴性(圖 2 A);不同濃度葡萄糖(15、50、150 mg/mL)或 LIF(50、100 ng/mL)處理 MG－63細胞，RUNX2表達同樣下降(P＜0.05)，見圖2B;高糖和LIF處理后的MG－63細胞，OPN和OCN的表達也有明顯的下降(P＜0.05)，見圖2C和圖2D。證實了高糖或LIF對MG－63細胞成骨分化標志物的表達有抑制作用。

圖2 ELISA法檢測高糖及LIF干預后的成骨分化相關標志物表達水平 A:ALP;B:RUNX2;C:OCN;D:OPN。Fig．2 The expression levels of osteogenic differentiation－related markers after intervention of high glucose and LIF detected using ELISA assayA:ALP;B:RUNX2;C:OCN;D:OPN．

MG－63細胞經0、20、50、100 ng/mL 的 LIF 處理6 h后，通過實時定量PCR檢測成骨分化標志物ALP、OCN、OPN和 RUNX2的mRNA表達水平變化。經50 ng/mL或100 ng/mL LIF處理后ALP的mRNA表達水平顯著降低(P＜0.05，圖 3 A)，RUNX2的mRNA水平顯著降低(P＜0.05，圖3B)，OCN和OPN的mRNA水平也顯著減低(P＜0.05，圖3C和圖3D)，均呈劑量依賴性。證實LIF抑制成骨分化標志物mRNA的表達。

2.4 LIF干預MG－63細胞后STAT3信號通路因子表達

LIF通過激活STAT3/SOCS3信號通路介導成骨細胞分化，從而調節靶基因的表達，檢測STAT3/SOCS3在LIF干預后MG－63細胞中的表達情況。結果表明，LIF 干預 MG－63 細胞后不同時間(0.5、1、2、4 h，圖 4 A)、不同濃度(20、50、100 ng/mL，圖 4B)STAT3的mRNA水平無顯著差異。經50 ng/mL的LIF 干預后不同時間(2、4 h，P＜0.05，圖4 A)、不同濃度 LIF(20、50、100 ng/mL，P＜0.05，圖 4B)處理 2 h，SOCS3的mRNA水平上調。WB序列分析表明，50 ng/mL的 LIF 干預 MG－63細胞 0.5、1、2、4 h后，STAT3表達升高(P＜0.05，圖 4C)，LIF 處理 1、2、4 h后SOCS3的蛋白水平也明顯上調(P＜0.05，圖4D)，P－STAT3和SOCS3的表達也被證實呈劑量依賴性(P＜0.05，圖4E)，LIF 干預 MG－63細胞后 P－STAT3和SOCS3的表達增加(P＜0.05，圖4F)，證實 LIF干預MG－63細胞STAT3/SOCS3信號通路被活化。

2.5 LIF介導成骨分化相關標志物下調對STAT3激活的依賴性

為了更深入了解STAT3信號通路和LIF調節成骨細胞的關系，本次研究應用STAT3抑制劑JSI－124抑制STAT3信號通路，觀察LIF干預MG－63細胞后成骨分化標志物的表達情況(圖5 A)，50 nmol/L或100 nmol/L的JSI－124顯著減少P－STAT3的表達，STAT3的mRNA和蛋白水平未見明顯調節變化，經過JSI－124處理后SOCS3表達也明顯下調(圖5B)，經過50 nmol/L、100 nmol/L的 JSI－124干預及 50 ng/mL的LIF處理后，MG－63細胞的成骨分化標志物 ALP(圖5C)、RUNX2(圖5D)、OCN(圖5E)的mRNA水平較前有顯著變化(P＜0.05)。證實LIF介導的成骨分化標志物和STAT3活化有顯著聯系。

圖3 MG－63細胞經不同濃度的LIF處理6 h后，實時定量PCR檢測成骨分化標志物表達水平Fig．3 After treated with LIF of different concentrations for 6 hours，the levels of osteoblast differentiation markers in MG－63 cells were detected by Real－time PCR

圖4 LIF干預MG－63細胞STAT3和SOCS3的mRNA水平隨著不同時間和濃度的變化Fig．4 The mRNA levels of STAT3 and SOCS3 in MG－63 cells treated by LIF changed with time and different concentration

圖5 JSI－124對LIF干預MG－63細胞成骨分化標志物水平的影響Fig．5 Study on the effect of JSI－124 on the levels of osteoblast differentiation markers in MG－63 cells treated with LIF

3 討論

成骨細胞成骨受多種內在和外在因素共同影響［8］，外在因素主要為成骨細胞周圍的血供、炎癥及骨折斷端的固定等，而內在的因素主要是指成骨細胞內在細胞因子的影響。為了進一步研究高糖和LIF對于成骨細胞分化作用的影響，本研究利用酶聯免疫吸附實驗和RT－PCR實驗分別檢測了在不同濃度的葡萄糖和LIF干擾下成骨細胞成骨分化標志物的表達。其中酶聯免疫吸附實驗結果表明，隨著葡萄糖和LIF濃度的升高，成骨分化標志物ALP、RUNX2、OCN和OPN的表達水平逐漸降低，說明葡萄糖和LIF可以抑制成骨細胞的成骨作用。利用RT－PCR方法檢測不同濃度的葡萄糖和LIF對成骨細胞干擾后其成骨分化標志物mRNA水平的變化時，發現ALP、RUNX2、OCN和OPN的mRNA水平也逐漸降低，進一步證實葡萄糖和LIF均可抑制成骨細胞的成骨作用，證實了LIF可能是葡萄糖抑制成骨細胞成骨的關鍵信號因子，但通過何種途徑發揮作用尚不清楚。

STAT3/SOCS3通路是否在LIF誘導成骨細胞中發揮作用尚不清楚，已有研究［9］表明LIF具有介導多種信號通路的作用。在骨代謝、骨重建等方面也有作用，在敲除LIF的小鼠模型中發現了骨分化和重塑的途徑［10］。STAT3/SOCS3信號通路參與多種細胞的分化過程，SOCS3的缺失可能影響多種干細胞的分化［11］，其主要機制是細胞外信號與細胞膜上的受體結合，結合后傳遞到細胞漿內，與STAT蛋白結合磷酸化后，活化的STAT形成二聚體，向細胞核移動激活炎癥介質的產生。SOCS的特點是STAT信號通路可以激活前者的基因表達，而前者又可以抑制后者的繼續活化，是一對負反饋的調節通路［12］。本研究證實高濃度的LIF可以使成骨細胞STAT3/SOCS3的含量升高，加入抑制STAT的抑制劑JAI－124后觀察成骨作用的影響，發現JAI－124和LIF共同干擾成骨細胞后，成骨細胞P－STAT及SOCS3下降，說明JAI－124對STAT/SOCS3分子通路具有抑制作用，同時用RT－PCR的方法分別檢測的成骨分化標志物ALP、RUNX2、OCN及OPN的mRNA的變化，隨著JAI－124和LIF濃度的升高，成骨分化標志物ALP、RUNX2、OCN及OPN的mRNA顯著性升高，因此認為STAT/SOCS3信號通路是LIF發揮抑制成骨細胞成骨作用的關鍵信號通路，通過JAI－124抑制STAT3/SOCS3，可以降低或減輕LIF抑制成骨細胞成骨的作用。本研究發現糖尿病患者中炎性因子上調表達的同時伴隨著成骨分化標志物的降低，影響骨折的愈合，干擾STAT3/SOCS3信號通路即可抑制LIF干預成骨細胞的成骨作用。

4 結論

本研究探討了高糖對LIF/STAT3/SOCS3信號通路的作用，分析了LIF對成骨細胞分化的影響，研究結果提示LIF在成骨細胞分化和高糖誘導骨折延遲愈合中起到關鍵作用。本次研究最先發現了高糖通過調節LIF活化STAT3/SOCS3信號通路影響成骨細胞分化相關標志物相關因子的表達，揭示了STAT3/SOCS3信號通路參與高糖環境下LIF介導成骨細胞分化的作用。通過對高血糖與LIF/STAT3/SOCS3信號通路相關分子水平表達的研究，為2型糖尿病患者骨折延遲愈合的藥物治療提供新的作用靶點。