湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠卵巢功能及骨代謝的影響

郭東艷 范妤 程江雪 張小飛 史亞軍 鄒俊波

1．陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室/陜西中醫藥大學，陜西 咸陽712046

2．陜西中醫藥大學基礎醫學院，陜西 咸陽712046

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)也被稱為原發性卵巢儲備功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)，是指 40歲前的女性出現以閉經、不孕、血清雌激素水平低下、促性腺激素水平升高等卵巢功能衰竭為特征的疾病，是婦科內分泌領域的常見病。低雌激素狀態可繼發骨質疏松、風濕性關節炎、糖尿病等疾病的患病風險。目前西醫主要使用激素替代療法，長期應用雌激素易產生高血凝狀態、高血壓、水腫等副反應，且乳腺癌、子宮內膜癌的發病危險升高，嚴重危害健康［1］。

近年來，作用溫和的植物雌激素(phytoestrogen，PE)引起人們廣泛關注。植物雌激素是指從天然植物中提取，其結構與內源性雌激素相似的一類化合物，當體內雌激素水平較低時，能夠通過與雌激素受體結合模擬雌激素的理化作用［2］。湖北海棠是薔薇科蘋果屬(malusmill．)湖北海棠［malushupehensis(pamp．)rehd］的干燥葉，主要成分為黃酮類及茶多酚。有研究［3］表明其黃酮類成分具有植物雌激素活性，對去勢大鼠所致的骨質疏松有良好的治療作用，但具體作用機制尚不清楚。

本實驗在前期研究的基礎上，以灌胃雷公藤多苷片復制成年大鼠卵巢早衰模型，研究湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠的卵巢功能及骨代謝的影響，并初步探討其作用機制，為湖北海棠的進一步開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:8周齡成年SD雌性大鼠48只，體質量(250±20)g，由西安交通大學實驗動物中心提供，動物許可證號 SYXK－R(陜)2012－003。室溫，不禁食不禁水，適應性飼養一周后用于實驗。

1.1.2 實驗藥物及試劑:雷公藤多苷片購自湖南千金協力藥業有限公司(批號20131102);戊酸雌二醇(補佳樂)購自拜耳醫藥保健有限公司(批號17OA);兔抗鼠ERα多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司(貨號 bs－0725R);羊抗兔 IgG SABC免疫組化試劑盒(批號12I26C)購自博士德生物工程研究所;碘［125Ⅰ］雌二醇(E2)、［125Ⅰ］孕酮(P)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)放射免疫分析藥盒，均購買于北京北方生物技術研究所(批號均為20130920);大鼠堿性磷酸酶ELISA試劑盒、大鼠骨堿性磷酸酶 ELISA試劑盒、大鼠1，25(OH)2D3ELISA試劑盒，均購自上海酶科生物科技有限公司;過氧化物歧化酶(SOD)(批號20140726)、丙二醛(MDA)(批號20140721)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;HPD100型大孔樹脂購自河北滄州寶恩化工有限公司。

1.1.3 儀器:北京東華原超高速低溫抽出機;德國艾本德Centrifuge 5417R臺式冷凍高速離心機;多功能成像系統;北京伯樂BIO－RAD Model680酶標儀;德國徠卡Leica RM2235切片機;德國蔡司ZEISS顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 湖北海棠總黃酮的制備:湖北海棠總黃酮提取物按照參考文獻［4～6］制備提取純化并測定含量。五種黃酮類成分的含量分別為金絲桃苷0.78%、槲皮苷5.3%、根皮苷19.7%、槲皮素1.18%、根皮素7.78%。

1.2.2 卵巢早衰模型建立:參考相關文獻及前期預實驗結果［7－8］，將48只 SD大鼠適應性飼養1周后開始實驗，按照體重和隨機數字表分為空白組、模型組、戊酸雌二醇組及湖北海棠總黃酮高、中、低劑量組，每組8只。除空白組外，其余各組每日灌胃雷公藤多苷片(75 mg/kg)，連續造模14 d，復制卵巢早衰模型。每日定時做陰道涂片，觀察動情周期變化。

1.2.3 分組與給藥方法:從第15天開始，模型組灌胃生理鹽水(2 mL/kg);戊酸雌二醇組灌胃戊酸雌二醇(1 mg/kg);湖北海棠總黃酮高、中、低劑量組分別給予灌胃湖北海棠總黃酮(160、80、40 mg/kg)。每日1次，連續給藥21 d。

1.2.4 取材:末次給藥后禁食不禁水，16 h后通過水合氯醛麻醉，行腹主動脈采血，分離血清，－20℃保存備用。通過常規無菌操作法取大鼠雙側卵巢、子宮，稱重;取材二分之一置于－80℃保存備用，剩余置于4%甲醛溶液中固定。

1.2.5 觀察大鼠動情周期:每天早晨進行陰道脫落細胞涂片，HE染色后在光鏡下觀察動情周期變化，以判斷模型復制是否成功。

1.2.6 卵巢、子宮臟器指數測定:取大鼠雙側卵巢、子宮，去除周圍脂肪組織，用電子天平精密稱重，計算臟器指數［臟器指數(%)=臟器濕重(g)/體質量(g)×100%］，結果以百分數表示。

1.2.7 血清性激素水平檢測:采用放射免疫法測定血清中雌激素 (E2)、孕酮(P)、黃體生成素 (LH)和卵泡刺激素 (FSH)的水平。嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.8 卵巢、子宮形態學觀察:卵巢、子宮組織在4%甲醛溶液中固定48 h后，經脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、HE染色、封片后，在光鏡下觀察卵巢及子宮內膜的組織學變化。

1.2.9 血清堿性磷酸酶、骨堿性磷酸酶、1，25(OH)2D3的檢測:通過ELISA法檢測血清中ALP、BALP、1，25(OH)2D3含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.10 血清SOD活力、MDA含量的檢測:通過TAB法檢測血清中MDA的含量、WST－1法檢測血清SOD活力，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.11 SABC法檢測卵巢組織中雌激素受體ERα蛋白的表達:一抗為兔抗鼠ERα多克隆抗體，二抗用生物素標記的羊抗兔IgG，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，PBS代替一抗作為陰性對照，已知強陽性石蠟切片作陽性對照。結果使用 Image－pro plus7.1軟件測定圖片平均光密度(AOD)。實驗重復3次。

1.3 統計方法

采用SPSS 18.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，以均數±標準差(珋x±s)表示各組動物的指標數據，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠動情周期的影響

空白組雌性大鼠動情周期穩定，每個周期約3～4 d，分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期。造模2周，除空白組外，各組大鼠動情周期紊亂并延長，陰道脫落細胞失去各期典型的形態學特征，表明給予雷公藤多苷片后，大鼠卵巢功能被抑制，激素的周期性分泌被干擾。給予湖北海棠總黃酮灌胃治療3周后，各組大鼠動情周期逐漸趨于穩定，時間縮短，陰道脫落細胞回復正常周期性變化，且動情期角化細胞數量顯著增多。見圖1。

圖1 大鼠動情周期各時項陰道脫落細胞形態變化(HE，×100)Fig．1 Morphological changes of vaginal exfoliated cells at different periods of estrous cycle in rats(HE，×100)

2.2 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠卵巢指數、子宮指數的影響

雷公藤多苷片造模后，模型組大鼠子宮指數、卵巢指數、脾指數均較空白組降低，差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01);戊酸雌二醇組、湖北海棠總黃酮高劑量組大鼠子宮指數、卵巢指數、脾指數均較模型組升高，差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。模型組大鼠胸腺指數較空白組升高，戊酸雌二醇組、湖北海棠總黃酮高劑量組胸腺指數較模型組降低，具有顯著性差異(P＜0.01)。腎上腺指數各組間差異無顯著統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.3 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠血清性激素水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清E2、P含量降低，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01);戊酸雌二醇組及湖北海棠總黃酮高、中劑量組均能升高卵巢早衰大鼠血清E2、P水平，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。模型組大鼠血清LH較空白組升高，差異具有統計學意義(P＜0.01)，戊酸雌二醇組及湖北海棠總黃酮高、中劑量組均能降低大鼠血清LH水平，與模型對照組比較有極顯著性差異(P＜0.01)。各組血清FSH含量未見統計學差異(P＞0.05)。見表 2。

表1湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠臟器指數的影響(珋x±s，n=8)Table 1Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on organ index in rats with premature ovarian failure(珋x±s，n=8)

表2湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠血清性激素水平的影響(珋x±s，n=8)Table 2Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on serum sex hormone levels in rats with premature ovarian failure(珋x±s，n=8)

2.4 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠子宮內膜形態學影響

空白組大鼠子宮內膜較厚，約占子宮壁2/3，上皮以高柱狀分泌細胞為主，固有層可見較多子宮腺，且腺腔大，腔內可見分泌物，基質疏松，血管豐富。模型組子宮內膜薄，固有層子宮腺少，腺腔小，螺旋動脈稀疏。湖北海棠總黃酮不同劑量組與模型組比較，子宮內膜增厚明顯，上皮以高柱狀分泌細胞為主，固有層腺體增多，腺腔增大，腔內可見分泌物，基質疏松，多見螺旋動脈及豐富的毛細血管。見圖2。

2.5 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠卵巢組織形態影響

圖2 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠子宮內膜形態的影響(HE，×200)Fig．2 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on endometrium morphology in rats with premature ovarian failure(HE，×200)

空白組大鼠卵巢皮質可見各級卵泡相間分布，模型組與空白組比較，卵巢皮質中卵泡數量明顯減少，尤其生長卵泡(初級卵泡和次級卵泡)所占比例明顯下降，且閉鎖卵泡增加。雌激素組生長卵泡數量明顯多于模型組，且黃體數量接近空白組。湖北海棠各劑量組與模型組相比，生長卵泡與黃體數量均顯著增多，黃體多見。見圖3。

圖3 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠卵巢組織形態的影響(HE，×200)Fig．3 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on the morphology of ovarian tissue in rats with premature ovarian failure(HE，×200)

2.6 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠血清堿性磷酸酶、骨堿性磷酸酶、1，25(OH)2D3含量的影響

實驗結果顯示，模型組大鼠血清ALP、BALP活力顯著增加，與空白組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。戊酸雌二醇組及湖北海棠高、中劑量給藥組大鼠血清ALP、BALP活力均顯著下降，與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。與空白組比較，模型組大鼠血清1，25(OH)2D3含量顯著減少，差異有統計學意義(P＜0.01)。戊酸雌二醇組及湖北海棠不同劑量給藥組大鼠血清1，25(OH)2D3含量均顯著升高，與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05;P＜0.01)。見表 3。

表3 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠血清ALP、BALP及1，25(OH)2D3含量的影響(珋x±s，n=8)Table 3 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on serum ALP activity，BALP content and 1，25(OH)2D3content in rats with premature ovarian failure(珋x±s，n=8)

2.7 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠抗氧化能力的影響

模型組大鼠血清MDA含量顯著高于空白組，差異有統計學意義(P＜0.01)，戊酸雌二醇組、湖北海棠總黃酮不同劑量組血清MDA含量顯著低于模型組，具有顯著統計學差異(P＜0.01)。模型組大鼠血清SOD活力顯著低于空白組(P＜0.01)，戊酸雌二醇組、湖北海棠總黃酮不同劑量組血清SOD活力均高于模型組，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表4。

表4 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠血清MDA含量及SOD活力的影響(珋x±s，n=8)Table 4 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on MDA content and SOD activity in serum of premature ovarian failure rats(珋x±s，n=8)

2.8 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠卵巢組織雌激素受體的表達影響

空白組可見卵巢組織中雌激素受體在黃體中表達顯著，基質弱表達或不表達。模型組大鼠卵巢組織雌激素受體蛋白在黃體和基質中均呈現弱表達，與空白組比較具有顯著性差異(P＜0.01)。戊酸雌二醇組、湖北海棠總黃酮各劑量組中，雌激素受體的表達較模型組均增強(P＜0.01)，在黃體組織中表達增強。見圖4、表5。

圖4 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠卵巢組織雌激素受體(ERα)表達的影響(×200)Fig．4 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on estrogen receptor(ER alpha)expression in ovarian tissue of premature ovarian failure rats(×200)

表5 湖北海棠總黃酮對卵巢早衰大鼠卵巢組織中ERα的表達影響(珋x±s)Table 5 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on ER－alpha expression in ovarian tissue of premature ovarian failure rats(珋x±s)

3 討論

雷公藤多苷提取自傳統中藥雷公藤，具有免疫抑制、抗炎作用，主要用于治療類風濕關節炎、原發性腎小球腎病等自身免疫性疾病，其對生殖功能的抑制作用近年來被廣泛應用于建立卵巢早衰的動物模型。灌胃雷公藤多苷可損傷卵巢功能，使卵巢分泌的雌激素、孕激素減少，反饋性促進促性腺激素分泌升高，動情周期紊亂，導致卵巢功能減退和(或)衰竭［9］。本實驗中，給予大鼠灌胃雷公藤多苷片后，通過陰道脫落細胞學檢測，發現大鼠動情周期紊亂并延長，失去各期典型的形態學特征，表明給予雷公藤多苷片后，大鼠卵巢功能被抑制，激素的周期性分泌被干擾，卵巢早衰動物模型成功建立。

目前臨床治療卵巢早衰的常用方法有激素替代療法、誘導排卵法、免疫抑制劑療法等［10］，但由于其不良反應大、療效不穩定等原因，效果均不滿意。長期的低雌激素狀態常常會增加骨質疏松癥發生的風險。中藥中提取的植物雌激素來源廣泛，與內源性雌激素結構和功能類似，當體內雌激素水平較低時，植物雌激素可以發揮弱雌激素效應;當體內雌激素水平過高時，植物雌激素可以競爭性地結合雌激素受體(estrogen receptor，ER)，因此被稱為選擇性雌激素受體調節劑(selectiveestrogenreceptor modulators，SERMs)，且副作用較小，在婦女圍絕經期綜合征中療效顯著，顯示出良好的發展前景。湖北海棠總黃酮類是湖北海棠葉提取物，其中根皮苷含量最高，有報道［11］顯示，根皮苷可與雌激素受體結合，發揮雌激素作用。本研究中，給予卵巢早衰大鼠湖北海棠總黃酮治療后，血清中E2、P水平顯著升高，FSH水平下降，子宮及卵巢重量增加，卵巢內生長卵泡數量增多，子宮內膜增厚，腺體分泌功能增強，表明湖北海棠總黃酮能夠改善POF大鼠卵巢功能，并隨劑量增加，作用隨之增強。ALP和BALP由成骨細胞合成，是最常見的評價骨形成和骨轉換的指標，可反映成骨細胞活性，是骨形成的特異性生化指標［12］。血清中1，25(OH)2D3是機體活力最強的維生素D的代謝產物［13］，在骨形成過程中起著重要的作用。湖北海棠總黃酮組大鼠血清中ALP活力、BALP含量均顯著降低，1，25(OH)2D3含量均顯著升高，表明湖北海棠總黃酮能夠糾正由卵巢早衰引起的骨代謝紊亂，改善骨質疏松狀態。

線粒體是細胞的動力工廠，卵巢顆粒細胞中線粒體功能下降是卵巢早衰的早期信號［14］。活性氧(ROS)是線粒體能量代謝產物，活性氧自由基主要有超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧自由基、一氧化氮分子自由基等，失去電子的自由基將進行各種氧化還原反應，改變或損傷細胞的結構及功能［15］。超氧化物歧化酶(SOD)通過調控細胞內O2－和H2O2的穩態平衡清除ROS，消除或減輕超氧陰離子對細胞的損害。丙二醛(MDA)是顆粒細胞內氧自由基與細胞膜不飽和脂肪酸形成的脂質過氧化產物，反映細胞內脂質過氧化程度。MDA的生成量不僅反映氧自由基生成與否還反映脂質過氧化程度，因而測定MDA含量可推測脂質過氧化程度［16］。本研究發現，湖北海棠總黃酮能夠提高卵巢早衰大鼠血清SOD活力，降低MDA含量，通過增強體內抗氧化能力清除過剩的氧自由基保護卵巢功能。

雌激素受體是通過配體結合激活的一類核受體超家族成員，雌激素的生物效應受到雌激素受體的調控。目前研究［17］報道其有 ERα和ERβ兩種亞型，它們既可共存也可單獨表達。二者在體內廣泛分布，在子宮、卵巢、睪丸、骨等器官數量豐富。兩種ER的配體結合特性雖然相似，但ERα對雌二醇的親和力高于ERβ［18］。本實驗中，湖北海棠總黃酮能夠顯著促進卵巢組織中顆粒細胞、基質細胞ERα的表達，在促進雌激素、孕激素分泌的同時，通過增加卵巢組織細胞內雌激素受體的數量，提高雌激素的作用，恢復卵巢功能。

綜上所述，灌胃雷公藤多苷片后，成年大鼠卵巢儲備能力下降，表現出卵巢早衰典型特征。經湖北海棠總黃酮治療后，大鼠血清雌、孕激素水平升高，生長卵泡數量增多，卵巢功能顯著改善，同時湖北海棠總黃酮通過發揮其類雌激素樣作用對卵巢早衰繼發的骨質疏松起到治療作用。其作用機制與湖北海棠總黃酮增強了體內抗氧化能力、減輕卵巢內顆粒細胞損傷、增強顆粒細胞內雌激素受體的表達密切相關。