消腫止痛合劑對大鼠膝骨性關節炎軟骨中AMPK/mTOR信號通路影響的實驗研究

李金鵬 劉濤 何志軍 李巖 陳文 宋淵

甘肅省中醫院，甘肅蘭州730050

膝骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是最常見的關節疾病，主要表現為關節疼痛或功能障礙，晚期甚至導致關節變形。KOA的發病機制尚未完全闡明，但一般認為KOA主要由生物力學和遺傳因素以及外源性因素引起，包括創傷、細菌感染或基因突變，這些因素引起滑膜代謝的改變［1］。關節軟骨的損傷常常是不可逆的。藥物治療和外科治療都不能阻止KOA的進展，因此，KOA的治療主要集中于緩解、減少炎癥、改善或恢復關節功能、延緩疾病進展和提高生活質量［2］。在西醫中，藥物治療和外科治療是KOA的兩大主要干預措施。藥物治療起效很快，但總是伴隨著一定的副作用和胃腸道不良反應。手術治療費用昂貴，還伴有禁忌證和并發癥，限制了它的臨床廣泛應用。而中藥制劑在臨床治療KOA具有明顯療效，副作用低，價格低廉，并發現其具有促進軟骨細胞增殖、抑制亞硝普鈉誘導的軟骨細胞凋亡的作用［3］。本實驗通過觀察消腫止痛合劑對改良Hulth法KOA模型p－AMPK/mTOR信號轉導通路的變化，為消腫止痛合劑在治療KOA方面的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及藥物

10月齡SPF級健康Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質量(300±20)g，生產許可證號為SCXK(甘)2015－0036，由甘肅中醫藥大學實驗動物中心所提供。消腫止痛合劑(由甘肅省中醫院制劑科生產，生產批號20051122)，硫酸氨基葡萄糖片(0.314 g/片)(新興同仁藥業有限公司，國藥準字:H20041317批號:16030)。

1.2 試劑及儀器

EDTA緩沖液(上海西唐生物科技有限公司)，PrimeScript TM RT reagent Kit逆轉錄試劑盒(寶日醫生物技術有限公司，生產批號:DRR037)，SYBR Premix Ex Taq TM實時定量PCR試劑盒(寶日醫生物技術有限公司，生產批號:RR820 A)，E．Z．N．A．Total RNA KitⅠ(美國omega公司，生產批號:R6834－01)，TRIZOL 試劑(Invitrogen life technologies)，瓊脂糖(上海川翔生物科技有限公司);IL－6、MMP－3、COX－2試劑盒購于南京建成生物工程研究所;p－AMPK、mTOR抗體(生工有限公司);p－AMPK、mTOR引物(大連寶生物有限公司)。－80℃超低溫冰箱88400V60(美國 thermo公司);OLYMPUSCH光學顯微鏡(JAPAN);臺式高速冷凍離心機 CT14RD(德國Eppendorf公司);PCR熱循環儀 S1000(美國伯樂 Bio－rad公司);熒光定量PCR儀(美國Bio－rad iCycler iQ伯樂公司)。

1.3 模型分組及制備

按隨機數字表法分為4組，每組各20只。分為觀察組(消腫止痛合劑組)、對照組(硫酸氨基葡萄糖片組)、模型組、假手術組。適應性喂養1周。1周后，采用10%水合氯醛按照0.35 mL/100 g進行腹腔內注射麻醉，選取左膝關節;假手術組僅切開皮膚后直接將其縫合，其余大鼠均采用改良 Hulth法［4］造模:打開關節腔，用鑷子將髕骨向外側推至脫位，并屈曲膝關節，切斷前交叉以及內側副韌帶，再切除內側半月板。術后給予大鼠40萬U青霉素臀大肌注射1周。造模后大鼠全部存活，手術傷口未見紅腫及滲出，術后8～10 d基本愈合，傷口愈合后每日驅趕大鼠活動半小時，驅趕8周后KOA造模成功。

1.4 干預方法

參考《中藥藥理研究方法學》［5］根據人和大鼠的計量折算系數確定給藥量。觀察組給予消腫止痛合劑1.8 mL/(kg·d)灌胃。對照組給予硫酸氨基葡萄糖片按170 mg/(kg·d)研粉蒸餾水稀釋后灌胃;模型組造模后給予0.9%生理鹽水灌胃;假手術組自由飲水。灌胃8周后處死每組大鼠并取樣。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 血清生化指標檢測:心臟取血后，1 500 r/min離心15 min，分離血清，采用ELISA試劑盒測定IL－6、MMP－3、COX－2，使用酶標儀測定 OD 值，通過標準曲線計算每孔中的量。1.5.2 RT－PCR法檢測關節軟骨組織中 LC3、Beclin1、caspase－9 mRNA的表達［6］:用Trizol試劑(Invitrogen life technologies)提取總RNA，用Prime Script RT試劑盒(TaKaRa，大連，中國)將每個樣本的 2μg總 RNA反轉錄為cDNA。反轉錄條件:37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 30 min。所用的引物序列見表1。

表1 目的因子PCR擴增的引物核苷酸序列Table 1 Primer nucleotide sequences of amplified target factors for PCR

1.5.3 Western blotting法檢測關節軟骨組織中p－AMPK、mTOR 蛋白表達［7］:加入緩沖液提取蛋白，濕式電泳儀轉膜300 mA、60 min;5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h;Ⅰ抗和內參照抗體4℃孵育16 h;加入稀釋好的二抗(抗兔Ig G)，在室溫下孵育1 h，使用ECL(Amersham Pharmacia Biotech)顯影，并使用ChemiDoc XRS(BioRad)顯色。

1.6 數據統計方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差(珋x±s)表示，符合正態分布的計量資料采用單因素方差分析法，多重比較用LSD－t檢驗，組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布的計量資料采用秩合檢驗，以(設定檢驗水準)P＜0.05認為差異具有統計學意義，P＜0.01認為差異具有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 ELISA 檢測血清中 IL－6、MMP－3、COX－2水平

與假手術組相比，模型組血清中IL－6、MMP－3、COX－2水平高于正常組(P＜0.05);與模型組相比，觀察組、對照組血清中 IL－6、MMP－3、COX－2 水平明顯下降(P＜0.05);與對照組相比，觀察組IL－6、MMP－3、COX－2水平表達差異有統計學意義(P＜0.05)，見表 2。

表2大鼠血清中IL－6、MMP－3、COX－2含量比較(珋x±s)Table 2 Comparison of serum IL－ 6，MMP－3，and COX－2 in rats(珋x±s)

2.2 關節軟骨中 LC3、Beclin1、caspase－9mRNA 的表達

與假手術組相比，模型組關節軟骨組織中LC3、Beclin1mRNA表達減少，caspase－9 mRNA表達增加(P＜0.05);與模型組相比，觀察組、對照組關節軟骨組織中 LC3、Beclin1mRNA表達增高，caspase－9 mRNA表達降低(P＜0.05);與對照組相比，觀察組LC3、Beclin1、caspase－9 mRNA 表達差異有統計學意義(P＜0.05)，見表 3。

表3 大鼠關節軟骨組織 LC3、Beclin1、caspase－9 mRNA含量比較(珋x±s)Table 3 Comparison of the contents of LC3，Beclin1，and caspase－9mRNA in articular cartilage of rats(珋x±s)

2.3 關節軟骨中p－AMPK、mTOR蛋白表達的影響

與假手術組相比，模型組p－AMPK表達明顯減弱(P＜0.05)，且 mTOR表達增強(P＜0.05)。與模型組相比，觀察組、對照組可同時上調關節軟骨組織中p－AMPK水平，并下調mTOR蛋白表達;與對照組相比，觀察組p－AMPK、mTOR蛋白表達差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖 1、表 4。

圖1 各組 p－AMPK、mTOR蛋白表達比較(Western blot)A:假手術組;B:模型組;C:觀察組;D:對照組。Fig．1 Comparison of p － AMPK and mTOR protein expression between each group(Western blotting)A:Sham operation group;B:Model group;C:Observation group;D:Control group．

表4 消腫止痛合劑對關節軟骨p－AMPK、mTOR蛋白表達的影響(珋x±s)Table 4 Effect of anti－swelling and analgesic mixture on the protein expressions of p－AMPK and mTOR in the articular cartilage(珋x±s)

3 討論

KOA是多種因素共同作用而導致的復雜疾病，除關節置換術外，缺乏有效的治療方法，但仍不能有效解決關節活動的問題，也不能改善軟骨的破壞或相關炎癥。滑膜炎癥是骨關節炎關節中經常觀察到的現象，通過形成各種分解代謝和促炎介質，從而改變軟骨基質降解和修復之間的平衡，從而有助于OA的發病機制［8］。分泌的炎性分子如促炎細胞因子，是OA病理生理學干擾過程的關鍵介質。最近的證據表明包括IL－1、IL－6和TNF－α在內的細胞因子促進關節軟骨細胞外基質蛋白降解，它們也與其他細胞因子協同作用以放大和加速軟骨破壞［9］。IL－1β是能夠誘導軟骨細胞和滑膜細胞合成基質金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMP)的強效促炎細胞因子，是OA關節軟骨退變的關鍵介質。腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF－α)通常被認為參與軟骨增生性疾病。IL－6在KOA關節炎癥過程中釋放，在軟骨細胞和軟骨外植體中，隨著MMP－3和MMP－13產量的增加，IL－6可刺激軟骨細胞鈣化，降低蛋白聚糖含量。IL－6基因敲除的雄性小鼠可導致晚期KOA的發生，提示其在KOA軟骨破壞和骨重建的生物力學控制中作為關鍵介質［10］。而COX－2則廣泛參與前列腺素合成，能夠有效調節血小板聚集，促進前列腺素合成進而加重機體炎癥反應水平及紅腫熱痛癥狀。

自噬是一種高度保守的細胞行為，主要參與受損細胞器的清除，以重新循環或重復利用細胞內的大生物分子，以維持它們的穩態和促進細胞存活［11］。近年來的研究證實了自噬在各種組織中的存在，并在各種疾病的進展中起著重要的保護作用［12］。軟骨是一種特殊的間充質組織，研究表明在神經退行性疾病過程中并發軟骨自噬水平受到抑制。同時，細胞凋亡在軟骨退變過程中起著至關重要的作用，自噬水平升高可抑制細胞凋亡［13］。軟骨細胞的凋亡是椎間盤突出或OA等各種疾病的起始和驅動因素。因此，抑制細胞凋亡可能有助于軟骨修復和緩解癥狀。自噬水平的升高是抑制細胞凋亡的重要機制。目前的研究表明細胞自噬水平與KOA狀態之間存在高度的相關性［14］。因此，考慮如何減少軟骨細胞過度凋亡以預防和治療骨關節炎時，保持軟骨細胞增殖和凋亡的平衡是關鍵。軟骨細胞凋亡的機制是復雜的，尚未完全闡明。然而，它可能與多種信號轉導通路有關，其中AMPK/mTOR信號轉導通路被認為是軟骨細胞凋亡的重要途徑［15］。AMPK是一種異源三聚體蛋白，由α催化亞基和β、γ調節亞基組成，它能調控細胞的能量代謝并通過p53和m TOR調控細胞的凋亡。研究證實，在關節軟骨細胞中，AMPK都能被異常激活，AMPK磷酸化的激活可對mTOR、P13 K等一些在細胞能量代謝過程中的關鍵蛋白激酶進行調控，從而影響細胞凋亡［16］。Caspases－9 作為凋亡的執行者，它可以活化DNA斷裂因子，最終導致細胞死亡。通過AMPK/mTOR途徑降低Caspases－9活性，從而減輕KOA損傷所致的細胞凋亡。在自噬過程中，LC3是將細胞內LC3Ⅰ轉化成LC3Ⅱ，并且整合到自噬體膜上，當自噬體融合成溶酶體時LC3Ⅱ將會被降解，當發生KOA時可以檢測到LC3Ⅱ的濃度顯著增高，因為此時自噬體的融合障礙，LC3Ⅱ降解減少。Beclin－1蛋白也是重要的自噬分子標志，參與自噬前體的形成。Zhang等［17］研究發現在骨關節炎患者的軟骨細胞中可見到ULK1、Beclin1和LC3等自噬相關的分子減少，細胞自噬能力降低可能是其發病的一個新機制。

中醫學認為KOA屬于“骨痹”的范疇。骨痹首出于《素問·痹論》，指氣血不足或虧虛，風寒濕之邪傷于髓骨，表現出的病癥。而“本虛標實”是該病的主要特點。消腫止痛合劑主要作用是“益氣活血、消腫止痛”，由當歸、黃芪、生地、青皮、川芎、紅花、三七、木香、白芍、桃仁、澤蘭等藥物組成，君藥當歸、黃芪、川芎活血補氣祛瘀，消腫止痛，配桃仁、紅花加強其破瘀血、生新血之力，共為臣藥，合三七以行瘀、消腫、止痛功效，再配合青皮、木香行氣止痛，輔以生地、白芍涼血消瘀，澤蘭消散腫脹。

本研究發現，經消腫止痛合劑治療后，KOA大鼠血清 IL－ 6、MMP－3、COX－2水平降低，LC3、Beclin1、p－AMPK 的表達量增高，caspase－9、mTOR的表達量降低，說明消腫止痛合劑可能與p－AMPK/m TOR信號通路密切相關，通過上調軟骨細胞的自噬水平來防止KOA誘導的軟骨損傷，進而促進KOA關節軟骨損傷的修復，延緩關節軟骨退變，對軟骨起到一定的保護作用。