不同年齡段健康人群骨代謝指標Ⅰ型前膠原N末端前肽的特點分析

莊銘城 王小燕 林澤偉

普寧市人民醫院風濕免疫科，廣東普寧515300

世界衛生組織將骨質疏松定義為一種全身性骨骼疾病，其特點是骨量減少，微觀結構異常，導致骨骼強度降低，易出現骨折。到目前為止，通過雙能X線骨密度儀(DXA)測量骨密度(bone mineral density，BMD)是診斷骨質疏松的常用方法。然而，監測骨轉換標志物(bone turnover markers，BTMs)是觀察骨質疏松治療效果的有效手段［1］。BTMs的檢測是為了快速了解骨質疏松的生理狀態和對快速骨損者的認識。它們通常分為骨吸收標志物、骨形成標志物和破骨細胞控制因子［2－3］。I型前膠原前肽(type I procollagen propeptide，PINP)是從 I型前膠原中去除產生I型膠原的前肽之一，被認為是Ⅰ型膠原合成的標志。PINP濃度是使用標志物來確定骨質疏松患者抗吸收治療的有效性，并被國際骨壞死聯合基金會－國際臨床化學和實驗室醫學骨標志物標準工作組確認為最重要的 BTMs 之一［4－5］。PINP作為骨形成生化標志物參考區間的建立是臨床應用的必由之路［6］。雖然報道了不同國家人群的 PINP 參考區間［6－8］，但關于中國人群血清 PINP水平參考范圍的信息有限。因此，本研究的目的是通過自動化方法確定中國人群中PINP值的年齡相關血清參考區間。

1 材料和方法

1.1 一般資料

納入在2017年9月至2019年1月在我院進行一般體檢的健康人群并收集血樣。確定年齡特定的PINP參考范圍。從健康成年人(208名男性和370名女性)中收集了578份血樣，男性和女性群組的特征如表1所示。所有參與者均為健康成人，基于DXA檢測顯示BMD正常。本研究由醫院的倫理委員會批準，所有參與者均簽署知情同意書。

表1 受試者的基本特征Table 1 Characteristics of the subjects included in the study

1.2 PINP測定

在早上7:30至10:00之間禁食過夜后，以一致的方式收集用于PINP測量的血液樣品。使用Elec－sys總 PINP 測定法(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)在 E170模塊免疫學分析儀(Roche Diagnostics)上測量血清PINP濃度。根據制造商的規格，按照實驗室質量控制程序，用單批測定試劑測量所有樣品［9］。將具有高或低PINP濃度的樣品混合以產生5個PINP濃度間隔。分析樣品一式三份的血清樣品。將5個混合樣品的結果與預期值進行比較。根據臨床和實驗室標準協會(CLSI)指南EP05－A3，連續5 d測量每個樣品(每天2次，每次重復2次)。將來自不同濃度的兩種不同質量對照樣品和來自正常健康群體的5種人血清樣品用于該評估。根據CLSI指南EP17－A2，研究了PINP檢測的檢測能力。首先，測量60次重復的生理鹽水以確定空白極限(LoB;對于空白樣品可能觀察到的最高測量結果)。然后，將PINP值接近5μg/L的樣品描述為基于制造商規格的檢測下限。分析其5 d(重復5次)以確定檢測限(LoD)。

1.3 統計學分析

使用SPSS 19.0版和Excel 2013軟件進行所有統計分析。通過線性回歸評估測量的PINP值與預期的PINP值之間的關聯。通過方差分析計算具有95%置信區間的重復性和實驗室內精確度。為了建立參考區間，采用Tukey測試來消除異常值。然后進行Kolmogorov－Smirnov檢驗以分別評估亞群的PINP結果是否正常分布。如果結果的分布不是高斯分布，則進行對數變換以歸一化分布。計算分成年齡組數十年亞群的95%置信區間，2.5%、97.5%百分位數和四分位數間距(IQR;25%～75%)的幾何平均值。與年齡相關的參考區間被建議為分布的中心95%。Mann－Whity ney檢驗用于比較2個亞群之間的PINP水平。如果比較超過3個亞群，則使用Kruskal－Wallis檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

混合樣品的測量值與預期值之間的回歸分析結果如圖1所示。該試驗證明PINP的線性范圍為26.23μg/L～934.9μg/L(R2=0.9987，斜率=0.977，截距=1.945)，范圍為 26.23μg/L～934.9μg/L(R2=0.9987，斜率=0.977，截距=1.945)。重復性方差(CV)的范圍為0.93%～1.55%。實驗室內精密度的CV范圍為1.11%～2.85%(表2)。7個樣品的所有精密型材均低于制造商的規格?？瞻讟悠返乃薪Y果均為5.0 μg/L，共60次重復，因此，LoB計算為5.0 μg/L。PINP值接近5 μg/L的樣本結果范圍為5.29 μg/L～5.64 μg/L。樣品的最終 LoD 值確定為5.34 μg/L。這些結果表明本檢測方案和結果值得信任。

圖1 與預期值相比，前膠原I型N－末端前肽測量值的線性曲線Fig．1 Linearity curve of measured values of procollagen type I N－terminal propeptide compared to expected values

PINP的參考區間通過Tukey檢驗排除異常值后，共有21名受試者(5名男性和16名女性)被排除在外。PINP的中位數和參考區間總結見表2。在男性和女性中，血清PINP中位數分別為44.2μg/L(IQR，35.5～54.0)和 41.3μg/L(IQR，32.4～55.9)。男性人口中PINP水平略高于女性。然而，這種差異無統計學意義(P=0.129)。當在年齡組之間比較中位PINP水平時，男性和女性中最高的PINP水平分別在20～29歲年齡組(P=0.023)和50～59歲年齡組(P＜0.001)(表3)。

在PINP水平從20～29歲年齡組減少到30～39歲年齡組后，男性的PINP水平保持穩定。從20～29歲年齡組到40～49歲年齡組，女性的PINP水平下降趨勢也有所減少。然而，在50～59歲年齡組的女性中，PINP水平急劇增加。詳見圖2。

表2 使用質量控制樣品和人血清測量前膠原I型N－末端前肽的精確度曲線Table 2 Precision profiles of procollagen type I N－terminal propeptide measurement using quality control samples and human sera

表3 根據年齡組的血清前膠原I型N－末端前肽濃度的中位數和參考區間Table 3 Median and reference intervals of serum procollagen type I N－terminal propeptide concentrations according to age groups

圖2 健康中國男性(A)和女性(B)中PINP值的年齡相關分布Fig．2 Age－related distribution of P1NP values in healthy Chinese males(A)and females(B)

3 討論

在過去的10年中，已經開發了幾種BTMs來監測骨代謝［4］。PINP是最重要的BTMs之一，已被用于預測骨形成［10］。此外，在許多研究中，PINP水平的降低已被證明是預測骨折的標志物［11］。在開發自動化檢測PINP之前，手動分析是測量PINP濃度的唯一方法，因此限制了PINP的臨床應用。最近，針對PINP的高通量自動化分析已被引入臨床實驗室［12］。與手動方法相比，這些可以滿足PINP測量日益增長的需求，縮短周轉時間并提高性能。本研究獨立評估了E170模塊免疫分析儀上自動檢測總PINP檢測的性能，并證明該檢測具有出色的線性和精確性，檢測限制非常低。特別是總PINP測定顯示在極低濃度和極高濃度之間的范圍內接近完美的線性。此外，測定的重復性和實驗室內精密度分別低于2%和3%。這一特征和商業上可用的任何其他PINP分析方案一樣優秀［13］。本研究的檢測能力測試數據還表明，在該分析的臨床應用過程中可以準確地檢測出極低濃度的PINP。

本研究發現中國男性人群血清PINP水平與年齡呈負相關。PINP水平隨年齡增長而降低，直至40～49歲年齡組，它達到了50～59歲年齡組的最低水平。然后，從50～59歲年齡組到60歲以上年齡組略有增加。在其他男性隊列研究中也發現了這種與年齡相關的U形關系［14］，這一發現可能反映了年輕時的骨轉換活躍。Hu等［14］的研究結果與年齡相關的參考區間和男性中位數PINP水平的結果非常相似。然而，與澳大利亞男性隊列的年齡相關參考區間相比［12］，中國男性的PINP水平在20～29歲年齡組中較低，但在其他年齡組中較高。

在中國女性人口中，20～29歲和40～49歲年齡組之間也存在負相關。在50～59歲年齡組急劇增加后，PINP水平隨年齡增長而下降。這種獨特的PINP模式已在其他國家的人群中報道［14］，這可能反映了50～59歲年齡組中絕經后婦女的骨轉換加速［15］。比較人群中PINP水平的中位數，韓國女性的PINP水平高于澳大利亞、比利時或英國女性人群［16］。然而，它們與我國上海女性隊列的水平幾乎相同［14］。這些結果表明PINP水平在種族中可能不同。因此，在對臨床應用采用PINP測量時，必須為每個國家或地區建立參考區間。

本研究也存在一些局限性。首先，沒有考慮其他如激素水平，盡管通過BMD數據證實了骨骼狀態的正常性。其次，由于樣本量有限，不得不以10年為單位建立參考區間。由于無法選取足夠數量的健康老年男性和女性，因此無法指定超過60歲的受試者的參考范圍。第三，沒有考慮更年期狀態。本研究發現女性年齡組50～59歲的PINP水平增加，然而無法得出這種增加是由于雌激素缺乏引起的絕經后婦女。第四，根據更年期的存在，BTMs沒有對這項研究進行分析。然而，這些結果可能有助于對中國人群的骨轉換狀況進行適當的評估。它還為中國人群提供PINP水平，以便將來與其他人群進行比較研究。