重復經顱磁刺激對甲基苯丙胺依賴代謝的影響*

周亞男 楊 棟 羅銀利 楊 超

甲基苯丙胺(Methamphetamine，MA)是以苯丙胺為母體衍生而來的化學合成品，具有極強的耐受性和成癮性[1]，并且具有復吸率高、易獲得以及軀體戒斷癥狀不明顯等特點[2]。近年來，由于MA成癮者的人數逐年上升，MA依賴已是目前最嚴重的社會公共衛生問題之一[3]。重復經顱磁刺激(repetitive Transcranial Magnetic Stimulation，rTMS)作為一種無創的神經調控技術，近年來已逐步應用于物質成癮領域。研究發現rTMS可降低物質依賴者的渴求、提高戒斷率，但rTMS 應用于MA依賴的相關研究甚少[4]。代謝組學(Metabolomics)作為新興組學技術，已成為系統生物學的重要組成部分，它通過檢測體液或組織中存在的各種小分子代謝物，在疾病的早期診斷和治療檢測過程中發揮重要作用[5,6]。故本研究采用超高效液相色譜-高分辨質譜聯用(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-high Resolution Mass Spectrometry,UPLC-MS)技術測定MA依賴患者rTMS前后血漿代謝組學數據，采用多元變量統計分析方法篩選與MA依賴及其rTMS治療相關的差異性代謝物，分析關鍵代謝通路，探討MA依賴形成與代謝變化的關系，為MA依賴診治及rTMS的應用提供科學依據。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2018年4月～2019年11月期間在湖南省腦科醫院就診的甲基苯丙胺依賴患者30例納入研究組。入組標準：(1)符合美國精神障礙診斷與統計手冊第5版(DSM-V)甲基苯丙胺依賴的診斷標準；(2)年齡 18～60 歲；(3)處于急性脫毒后康復期，無明顯軀體戒斷癥狀；(4)無明顯軀體、精神疾病；(5)不愿接受常規戒毒治療。排除標準：(1)不能遵守研究要求者；(2)有DSM-V 其他精神活性物質依賴史者；(3)有重大軀體疾病、重性精神障礙、腦器質性疾病或顱腦外傷者；(4)既往有癲癇發作或有癲癇病家族史者；(5)有心臟起搏器植入或耳蝸植入者。從湖南省腦科醫院體檢中心招募健康志愿者30名納入對照組。研究組男20例，女10例，平均年齡(31.53±3.66)歲；對照組男19名，女11名，平均年齡(32.32±4.33)歲。兩組性別和年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究獲得湖南省腦科醫院倫理委員會的批準，研究開始前所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 Vanquish型超高效液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific公司)，Q Exactive HFX 型高分辨質譜儀(Thermo Fisher Scientific公司)；PS-60AL型超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)；YRDCCY-1 型經顱刺激儀(武漢依瑞德有限公司)。

1.2.2 治療方法 研究組進行rTMS干預，使用環型線圈(外徑 125 mm)，線圈放置與顱骨平行,治療部位為左背外側前額葉,刺激頻率為 10 Hz，刺激強度為 100% 運動閾值，每序列 50 次脈沖，每天 40 個序列，每串刺激 5 s，間歇 10 s，每次治療共2 000次脈沖。每周進行5次治療，干預時間為 4 周。對照組不予任何處理。

1.2.3 行為學觀察 采用強迫性毒品使用量表(OCDUS)[7]分別于rTMS干預前、干預后，對研究組的心理渴求現狀展開評估。該量表一共13個條目，各個條目均采取李克特5點評分，1～5分分別對應沒有～非常多，總分為每個條目評分之和，總分越高渴求程度越高。

1.2.4 樣品采集及處理方法[8]分別于rTMS干預前、干預后兩次采集研究組靜脈血進行代謝組學檢測，對照組采集1次即可。具體步驟：采用促凝真空采血管收集受試者空腹肘靜脈血10 ml，上下顛倒混勻，快速于4 ℃，3 500 r/min離心15 min。移取100 μl樣品至EP管中，加入400 μl提取液[甲醇∶乙腈=1∶1(V/V)，含同位素標記內標混合物]，渦旋混勻30 s后超聲10 min(冰水浴)，于-40 ℃靜置1 h。將樣品4 ℃，12 000 rpm離心15 min，取上清上機檢測。另外制備QC樣品，由所有樣品取等量上清混合。

1.2.5 樣品采集及處理方法[9]色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)液相色譜柱，流動相：水(含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水)(A)：乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，95%～65% B；7～8 min，65%～40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，40%～95% B；9.1～12 min，95% B。流動相流速：0.5 ml/min，柱溫：30 ℃，樣品盤溫度：4 ℃，進樣體積：2 μl。流動相使用前超聲脫氣。

1.2.6 質譜條件 樣品質譜數據分別以正負離子掃描模式采集，離子源參數如下：鞘氣流速：50 Arb；輔助氣體流速：10 Arb；毛細管溫度：320 ℃；碰撞能量：10/30/60V；電噴霧電壓：3.5 kV(+)或-3.2 kV(-)。

2 結果

2.1 研究組rTMS治療前后OCDUS評分比較 研究組rTMS治療后OCDUS總分及毒品的影響、渴求的頻率及毒品失控評分均較治療前降低(P<0.001)。見表1。

表1 研究組rTMS治療前后OCDUS評分比較

2.2 質量控制 樣品檢測過程中實時地對質控樣品(Quality Control, QC)進行檢測，以評價分析系統的穩定性，確保采集數據的質量[6]。經檢測，QC樣品間差異小(≤±2 STD)，相關性越接近于1，重復性良好，分析系統穩定，結果穩定可靠。見圖1。

注：A-正離子模式，B-負離子模式

2.3 多元變量統計分析 對照組(組1)、研究組基線時(組2)、研究組經rTMS干預后(組3)血漿樣品經LC-MS分析得到數據，采用PCA對三組血漿的代謝譜圖進行分析，得到相應的散點分布圖。PCA結果表明，三組樣本間呈現一定的分離趨勢，結果如圖2所示。為避免PCA模型或PLS模型分析中相關變量造成的差異變量分布不均，故需采用OPLS-DA對結果進行分析。見圖3。通過7折交叉驗證(7-fold cross validation)得到R2Y(模型對分類變量Y的可解釋性)和Q2(模型的可預測性)，通過置換檢驗(permutation test)，隨機多次(次數n=200)改變分類變量Y的排列順序，建立對應的OPLS-DA模型獲取隨機模型的R2Y和Q2值。結果表明，對照組和研究組基線時的R2Y、Q2分別為0.96、-0.30(正離子模式)和0.98、-0.25(負離子模式)；研究組基線時和研究組經rTMS干預后的R2Y、Q2分別為0.93、-0.21(正離子模式)和0.97、0.12(負離子模式)。總體來說模型具有良好的穩健性。

注：A-正離子模式，B-負離子模式

注：組1與組2：A-正離子模式，B-負離子模式；組2與組3：C-正離子模式，D-負離子模式

2.4 差異代謝物篩選 根據OPLS-DA模型獲得VIP值，篩選出VIP>1且t檢驗(Student’st-test)P<0.05的差異代謝物。與對照組比較，研究組基線時血漿中共篩選出34個差異代謝物(正離子模式11個，負離子模式23個)。其中，可替寧、2-甲基吡啶、L-谷氨酸、1H-吡咯-2-甲醛、羥基煙堿、5′-羥基煙堿等15個代謝物下調(P<0.05)，亮氨酰-異亮氨酸、3-吲哚乙腈、紅藻膠等19個代謝物上調(P<0.05)。見表2。

表2 正負離子模式下兩組基線時的差異代謝物

與研究組基線時比較，研究組經rTMS干預后血漿中共篩選出36個差異代謝物(正離子模式29個，負離子模式7個)。其中，(±)-赤型異亮氨酸、D-脯氨酸、次黃嘌呤等33個代謝物下調(P<0.05)，同型半胱氨酸、對苯二甲酸及15-棕櫚酸甲酯上調(P<0.05)。見表3。

表3 正負離子模式下研究組基線時和研究組經rTMS干預后的差異代謝物

2.5 差異代謝物的代謝通路分析 利用MetaboAnalyst平臺(https://www.metaboanalyst.ca/)對組1與組2差異代謝物進行通路綜合分析(包括富集分析和拓撲分析)，找到與差異性代謝物相關性最高的關鍵通路[12]，結果以氣泡圖展示。見圖4。根據圖4-A，正離子模式下共篩選出6條組1與組2的差異代謝通路，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，亞油酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，氨基酰基-tRNA生物合成，精氨酸和脯氨酸的代謝。根據圖4-B，負離子模式下也篩選出6條組1與組2的差異代謝途徑，包括脂肪酸生物合成，花生四烯酸代謝，咖啡因代謝，α-亞麻酸代謝，硫代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝。正負離子模式檢測下，主要涉及氨基酸代謝和能量代謝，其中氨基酸代謝途徑檢測到的差異性代謝物最多。同理，對組2與組3差異代謝物進行通路的綜合分析。根據圖4-C，正離子模式下共篩選出6條組2與組3的差異代謝通路，包括氨基酰基-tRNA生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，生物素代謝，及組氨酸代謝。根據圖4-D，負離子模式下也篩選出6條組2與組3的差異代謝途徑，包括氮代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，牛磺酸和亞牛磺酸代謝，硫代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，果糖和甘露糖代謝。

注：組1與組2：A-正離子模式，B-負離子模式；組2與組3：C-正離子模式，D-負離子模式

3 討論

MA依賴者心理渴求重、戒斷困難，復吸率一直居高不下[13]。發現治療新技術及新模式，是MA依賴治療成功的關鍵。rTMS是一種廣泛運用的非侵入性臨床治療技術，通過調節大腦神經電生理活動達到治療精神疾病的目的[14]。Liu T等[4]發現高頻rTMS治療女性依賴者可耐受且有效。本研究為保證試驗準確性，為急性脫毒后不愿進行常規脫毒的MA依賴者進行為期4周rTMS治療，發現OCDUS總分及毒品的影響、渴求的頻率及毒品失控評分均較治療前降低。因此，說明rTMS可降低MA依賴者對MA的渴求程度。

目前，國內外對基于上調LC-MS的MA依賴及其血漿的代謝組學研究鮮見報道。代謝物作為生物體表型的直接體現，可以放大表達基因、轉錄、蛋白質層面的差異[10]。本研究采用非靶向代謝組學技術，探討MA依賴患者給藥前后血漿中代謝物的變化，與文獻報道的相關代謝分析[1]比較，本研究建立的方法從正負模式系統全面的代謝通路進行分析。本研究QC檢測證實中所獲得的代謝產物能夠真實反映樣本組間的生物學差異，采卡值標準結合OPLS-DA模型篩選出組間差異代謝物，并通過聚類分析說明本研究中所篩選的代謝物合理。

與對照組相比，研究組基線時在D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，亞油酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等方面發生不同程度的紊亂。其中天冬氨酸在酶的催化作用下發生轉氨基作用生成天冬酰胺，同時將谷氨酰胺轉變為谷氨酸。谷氨酸是中樞神經系統最重要的興奮性遞質之一，興奮性毒性與胞外谷氨酸濃度增加，過度激活受體有關。正常情況下，細胞膜上谷氨酸轉運體能逆濃度梯度從胞外向胞內攝取谷氨酸，維持胞外谷氨酸濃度的動態平衡。谷氨酸轉運體有多種亞型，已有研究報道，兩種主要的谷氨酸轉運體：囊泡膜谷氨酸轉運體和質膜型谷氨酸轉運體1，在防治MA引起的神經損傷中具有重要作用[15]。結合本研究結果，進一步證實谷氨酸代謝在MA依賴中可能起著關鍵的作用。本研究發現rTMS治療后氨基酰基-tRNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等方面進行一定程度調節。氨基酰基-tRNA生物合成主要反映出細胞中蛋白質的生物合成；脯氨酸是谷氨酸的代謝衍生物，同時也是生糖氨基酸，可代謝生成三羧酸循環中間產物α-酮戊二酸；精氨酸參與鳥氨酸循環，促進尿素的形成[16]。根據研究組基線時和研究組經rTMS干預后正負離子模式數據分析可知，主要涉及氨基酸代謝和能量代謝，其中氨基酸代謝途徑檢測到的差異性代謝物最多。因此，rTMS可能通過氨基酸代謝降低MA依賴的渴求程度。

本研究所建立的方法能全面系統地鑒定出與MA依賴及其治療相關的代謝物和代謝通路，同時也存在一定局限性，如各組樣本量較小。研究結果有助于闡明MA依賴的發病機制，為臨床診斷及治療提供思路。