大孔樹脂提取側孢短芽孢桿菌抗菌肽brevilaterin

寧亞維，張明星，蘇丹，付浴男，侯琳琳，王志新，賈英民

1(河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊，050018) 2(北京工商大學 食品與健康學院，北京，100048)

隨著人們對食品安全的重視，防腐劑的安全性越來越受到人們關注。生物防腐劑為來源于動物、植物、微生物等生物的一類防腐劑，因具有較化學防腐劑更高的安全性而受到人們青睞。其中，微生物源防腐劑因生產周期短、發酵成本低等原因成為目前生物防腐劑開發的重點。微生物抗菌肽是由微生物如乳酸菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等代謝產生的一種具有抑菌活性的小分子肽[1]，目前已經商品化生產且得以廣泛應用的抗菌肽為乳酸鏈球菌素。然而乳酸鏈球菌素在使用中存在一定的局限性，如僅對革蘭氏陽性細菌抑制效果好，對革蘭氏陰性菌卻難以抑制。因此有必要尋求廣譜、高效抑菌的抗菌肽以減少防腐劑的使用種類。本實驗室前期從土壤中篩選到1株能夠高產抗菌肽brevilaterin的側孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)S62-9[2]，前期研究發現brevilaterin具有抑菌譜廣、抑菌活性高、酸熱穩定性好等優點，在食品防腐中具有較高的應用潛力[3]。但brevilaterin存在于成分復雜的微生物發酵液中，需要提取純化才能進一步開發應用。因此，本研究擬開發brevilaterin綠色高效提取技術，以期為brevilaterin的工業化生產提供技術支持。

近年來，大孔樹脂吸附技術因產物提取效率高、溶劑損耗小、樹脂再生處理方便等優點被廣泛用于天然產物的提取，如從蜂蜜中提取黃酮、甜葉菊中提取糖類、霉菌中提取生物堿等[4-7]。本研究采用大孔樹脂提取側孢短芽孢桿菌發酵液中的抗菌肽brevilaterin，首先以樹脂對brevilaterin的吸附解吸附能力為評價指標，從8種大孔樹脂中篩選了一種吸附效率好、解吸附率高、回收效果好的樹脂，然后優化了其吸附-解吸附的工藝條件，最后進行了吸附機理的探究。本研究為發酵液中抗菌肽的提取提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BrevibacilluslaterosporusS62-9和StaphylococcusaureusATCC 25923為河北科技大學食品生物技術與安全實驗室保藏[8]；HPD722、HPD600、HPD5000樹脂，分析純，北京索萊寶有限公司；NKA-Ⅱ、AB-8、D4020、XAD7HP、XAD1180樹脂，分析純，杭州全豐有限公司。樹脂相關參數如表1所示。

表1 大孔吸附樹脂性質

1.2 儀器與設備

UV2300Ⅱ紫外分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；3-18K高速冷凍離心機，德國Sigma公司；BIOTECH-5BG-7000 5 L發酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；Scan1700全自動菌落計數儀，法國Interscience公司。

1.3 方法

1.3.1 種子菌懸液及發酵液制備

將B.laterosporus從甘油管中接入營養肉湯培養基中，于32 ℃，240 r/min的轉速培養24 h，然后按照體積分數3%的接種量接入營養肉湯培養基制備B.laterosporus種子液。將種子菌懸液按接種量體積分數5%接種到發酵培養基中(液糖6%，魚蛋白胨1.2%，無水CaCl21.38 g/L，ZnCl28.16 mg/L，Tween-20 0.2%，pH 7.0)，于轉速300 r/min、溫度32 ℃條件下在5 L發酵罐中發酵24 h。發酵結束后，將發酵液高壓滅菌20 min，然后冷凍離心去除菌體，收集上清液置于4 ℃備用。

1.3.2 抗菌肽brevilaterin抑菌活性的測定

將滅菌后冷卻至50 ℃左右的營養瓊脂培養基倒入添加有S.aureus菌懸液(體積分數3%)的平皿中，搖勻并靜置凝固后，將牛津杯置于營養瓊脂表面，加入50 μL待測抗菌肽brevilaterin樣品，于4 ℃冰箱中預擴散10 h，然后放入37 ℃恒溫培養箱中培養12 h，用全自動菌落計數儀測量待測樣品的抑菌圈直徑。

采用二倍稀釋法測定brevilaterin的抑菌效價，參考HéCHARD等[9]的實驗方法進行適當修改。將樣品用生理鹽水進行二倍稀釋，然后用牛津杯法測定抑菌圈大小，將第1個不出現肉眼可見抑菌圈的稀釋液的效價定義為1 AU/mL。根據效價計算公式(1)可以得到樣品對S.aureus的抑菌效價:

效價/(AU·mL-1)=2n×(1 000 μL÷50 μL)

(1)

式中：n，第1個不出現肉眼可見抑菌圈的稀釋液二倍稀釋的次數。

1.3.3 大孔樹脂篩選與工藝條件優化

大孔樹脂均采用無水乙醇浸泡24 h后，用去離子水洗至無乙醇味，除去多余水分備用。向盛有30 mL同一批次brevilaterin發酵液的250 mL錐形瓶中加入不同種類的大孔樹脂0.9 g，分別于37 ℃條件下200 r/min振蕩90 min。然后將上述吸附有抗菌肽的大孔樹脂加入250 mL錐形瓶中，加入50∶1(乙醇體積∶樹脂質量)的乙醇溶液(體積分數分別為70%、75%、80%、85%、90%、95%)，在37 ℃下200 r/min振蕩24 h進行抗菌肽解吸附。然后抽濾收集濾液，旋轉蒸發去除乙醇得到brevilaterin濃縮液。測定brevilaterin濃縮液效價，并根據公式(2)和公式(3)計算吸附量與吸附率，篩選吸附效率高的大孔樹脂用于后續研究。

以篩選的高吸附率大孔樹脂為吸附劑，研究吸附時間(10～180 min)、吸附溫度(20～40 ℃)、大孔樹脂添加量(10～50 g/L)和發酵液pH值(4～8)對抗菌肽吸附率的影響；基于上述優化條件，考察乙醇濃度(70%～95%)、乙醇體積/樹脂質量(10∶1、20∶1、30∶1、50∶1、70∶1)、解吸附溫度(20～40 ℃)與時間(20～120 min)對解吸附率的影響，最終綜合吸附量、吸附率和回收率3個指標選取最佳提取條件。

根據以下公式計算吸附量Qt、吸附率A、解吸附率D與回收率R。

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：C0,brevilaterin發酵液初始效價,AU/mL；Ce,吸附平衡后上清液的效價,AU/mL；Vi,加入brevilaterin發酵液的體積,mL；m,加入大孔樹脂的干重,g；Cd,樹脂解吸附后旋蒸液的效價,AU/mL；Vd,大孔樹脂解吸附后旋蒸液的體積,mL。

1.3.4 吸附等溫線與吸附熱力學

在25、30、35 ℃溫度下，分別用大孔樹脂XAD-7HP(30 g/L)吸附效價為4 200、4 000、3 600、3 300、3 000 AU/mL的brevilaterin溶液，200 r/min振蕩吸附3 h，收集上清液并測定效價，計算吸附量Qe和平衡濃度。以吸附量Qe對抗菌肽吸附平衡濃度作圖，得到等溫吸附曲線，采用Langmuir模型與Freundlich模型擬合。吸附等溫線與熱力學方程如公式(6)～(11)所示：

(6)

(7)

(8)

(9)

ΔG=-nRT

(10)

(11)

式中：Qe,單位質量吸附劑對吸附物的吸附量,AU/g；Qmax,單位質量吸附劑對吸附物的最大吸附量,AU/g；RL,無量綱因子；KL,Langmuir方程的吸附常數(mL/AU，與結合位點、親和力有關)；Ce,吸附后上清中被吸附物的濃度,AU/mL；C0,初始吸附物濃度,AU/mL；KF、1/n,Freundlich方程的吸附常數；K，Langmuir方程的吸附平衡常數，KL；R與T分別為理想氣體常數，8.314 J/(mol·K)和絕對溫度(K)；A、ΔH、ΔS與ΔG分別為常數、焓變(kJ/mol)、吉布斯自由能(kJ/mol)與熵變(J/mol·k)。

1.3.5 吸附動力學

在35 ℃下，采用大孔樹脂XAD-7HP(30 g/L)吸附效價分別為2 200、2 400、2 600、2 800、3 000 AU/mL的brevilaterin溶液，吸附不同時間(2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、90、120、180 min)后，收集上清液測定效價。對擬一級動力學方程、擬二級動力學方程、Elovich方程和粒子擴散方程進行非線性擬合[10-11]。

吸附動力學方程如公式(12)～(15)所示：

ln(Qe-Qt)=lnQe-K1t

(12)

(13)

(14)

(15)

式中：Qt,t時刻吸附劑對吸附物的吸附量,AU/g；K1,吸附速率常數,min-1；K2,吸附速率常數,min-1；a,初始吸附速率[AU/(g·min)]；b,解吸常數,g/AU；C,截距,AU/g；Kt,顆粒內擴散速率常數,[AU/(g·min0.5)]。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂的結構與特性(如孔徑、表面積)是決定樹脂吸附能力的關鍵因素[12-13]，因此選取8種不同樹脂考察對抗菌肽brevilaterin的吸附解吸附能力，結果如圖1所示。

A-大孔樹脂種類對brevilaterin吸附率的影響；B-乙醇濃度對大孔樹脂提取brevilaterin解吸附率的影響；C-解吸附時間對大孔樹脂提取brevilaterin回收率的影響

從圖1-A中可知，樹脂D4020的吸附率最高，達到了95.64%；其次是HPD722、XAD-7HP和XAD1180分別是94.43%、94.09%和92.81%；其中吸附率最低的是樹脂NKA-Ⅱ為31.79%。由表1可知，NKA-Ⅱ與HPD600均為極性樹脂，然而兩者吸附能力差異極顯著，表明brevilaterin吸附率與大孔樹脂極性不相關，推測可能與樹脂比表面積有關[14]。

不同樹脂對抗菌肽brevilaterin的解吸附能力不同，會影響brevilaterin的回收率，因此進一步通過解吸附率篩選對抗菌肽提取率高的大孔樹脂(圖1-B)。結果顯示乙醇濃度對解吸附率影響較大，乙醇濃度增大反而不利于brevilaterin的解吸附；樹脂類型可影響解吸附率，其中D4020樹脂解吸附率較低，推測brevilaterin與該種樹脂結合較強，因此brevilaterin難以解吸附下來[15]。根據回收率選取了在70%乙醇濃度下回收率較高的4種樹脂HPD722、XAD-7HP、HPD5000和XAD1180進行解吸附時間比較。由圖1-C可以看出樹脂XAD1180的回收率低于其他樹脂，而樹脂XAD-7HP(2 h)與HPD5000(2 h)達到了80%以上，再根據樹脂的吸附能力，最終選擇XAD-7HP大孔樹脂進行brevilaterin的提取。

2.2 大孔樹脂提取brevilaterin的工藝條件優化

2.2.1 大孔樹脂吸附brevilaterin的工藝條件優化

首先考察了大孔樹脂XAD-7HP吸附時間對brevilaterin吸附率的影響(圖2-A)，結果表明初始10 min吸附較快，吸附率達到40.5%；隨著吸附量的增加，吸附速率減緩，在90 min時吸附率達到94%，之后繼續延長吸附時間吸附率增加不顯著，因此選擇樹脂吸附時間為90 min。其次，考察了吸附溫度對brevilaterin吸附率的影響(圖2-B)，發現溫度對吸附率影響顯著，升高溫度有利于brevilaterin的提取。吸附溫度增加到35 ℃時，吸附率達到95%，之后增加溫度對吸附率提高不顯著。綜合考慮提取效率與能耗，選取35 ℃進行后續研究。然后，考察了大孔樹脂添加量對brevilaterin吸附率的影響(圖2-C)，結果顯示大孔樹脂的最佳添加量為30 g/L，此時brevilaterin的吸附率達到了94.4%，吸附量為43 394 AU/g。最后，研究了發酵液pH對brevilaterin吸附率的影響(圖2-D)，結果發現發酵液pH值對brevilaterin吸附率無影響，無需調節發酵液pH值即可提取brevilaterin。

A-吸附時間對吸附率的影響；B-吸附溫度對吸附率的影響；C-樹脂添加量對吸附率及吸附量的影響；D-發酵液pH值對吸附率的影響

2.2.2 大孔樹脂解吸附brevilaterin的工藝條件優化

在上述大孔樹脂篩選得到的解吸附工藝條件基礎上，進而考察了解吸附溫度(圖3-A)與乙醇用量(圖3-B)對brevilaterin解吸附率的影響，研究發現解吸附效率隨溫度升高先升高后降低，在25與30 ℃時效率最好，選擇室溫25 ℃進行brevilaterin解吸附。此外，研究了乙醇用量對brevilaterin解吸附效率的影響，發現乙醇用量對解吸附效率有顯著影響，當乙醇與大孔樹脂液料比為50∶1(mL∶g)時，解吸附效率最好，因此選取乙醇大孔樹脂液料比為50∶1。

A-解吸附溫度對brevilaterin解吸附率的影響；B-乙醇與大孔樹脂比例對brevilaterin解吸附率的影響

2.3 大孔樹脂吸附brevilaterin機理研究

2.3.1 吸附等溫線與吸附熱力學

采用Langmuir與Freundlich模型對樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin的實驗數據進行擬合，結果如圖4所示。從表2可以看出Langmuir與Freundlich模型擬合的R2都大于0.90，表明大孔樹脂XAD-7HP對brevilaterin的吸附符合單分子層模型[16]。其次，由Langmuir參數可求出表示吸附劑與被吸附物質之間親和性的無量綱因子RL：當01時不利于吸附；當RL=1時是線性吸附；當RL=0時是不可逆吸附[17-19]。由圖3-C可知，RL值小于0.05，且隨著C0的增加逐漸趨近于0，表明brevilaterin有利于大孔樹脂吸附[20]。此外，實驗數據與Freundlich方程的擬合度也較好(R2>0.92)，方程中1/n表示吸附能力：1/n在0.1～0.5范圍時吸附容易發生，1/n>1時表示吸附發生困難[21]。Freundlich方程的1/n在0.1～0.5之間，說明XAD-7HP對brevilaterin的吸附易發生。

熱力學參數可以提供吸附過程中能量變化信息[22]，根據公式(9～11)計算不同溫度下的ΔH、ΔG與ΔS(表2)，結果顯示ΔH>0，說明樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin的過程為吸熱過程，與吸附工藝條件優化結果提高溫度可以增加吸附率結果一致。不同溫度下ΔG<0，說明吸附過程是自發的。ΔH

A-Langmuir等溫線模型擬合結果；B-Freundlich等溫線擬合結果；C-無量綱因子RL隨抗菌肽初始濃度變化的曲線

表2 大孔樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin的熱力學參數

2.3.2 吸附動力學

吸附動力學研究主要涉及底物在大孔吸附樹脂表面吸附過程中的擴散行為模式，研究分別采用擬一級動力學、擬二級動力學、Elovich方程與粒子擴散模型對大孔樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin的實驗數據進行擬合(圖5)，相關動力學參數如表3所示。由時間吸附曲線(圖5-A)可以看出吸附分3個階段，即0～30 min快速吸附、30～60 min緩慢吸附、60 min后吸附逐漸達到平衡，因此樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin屬于快速吸附[23]。擬一級動力學通常適用于吸附過程的初始階段，擬二級動力學模型假設限速步驟為化學吸附，并可以預測整個吸附過程的行為[24]。依據表3數據可知(以抗菌肽2 200 AU/mL為準)，擬二級動力學R2(0.997)優于擬一級動力學R2(0.946)，且擬二級動力學模型Qe計算值為75 208 AU/g與Qe實驗值73 157 AU/g接近，表明XAD-7HP吸附brevilaterin符合擬二級動力學[25]，主要吸附機制為化學吸附。上述大孔樹脂XAD-7HP對brevilaterin的吸附機制與樹脂D301對重金屬粒子以及XAD-16樹脂對黃酮類化合物的吸附機理相似，吸附過程均符合擬二級動力學模型，以化學吸附為主[22,26]。

Elovich方程描述了非均質表面的化學吸附，通常用于證實化學吸附機理[27]。Elovich方程的相關參數如表3所示，該方程的R2為0.92，再次表明化學吸附是主要的吸附機制。粒子擴散方程雖然不能代表整個吸附過程，但可以用來給出一個明確的吸附機制[24]。粒子擴散方程評估膜擴散或內部擴散對擴散過程的控制。根據文獻，如果粒子擴散方程圖為直線且經過零點，則說明粒子內擴散是控制吸附的重要因素，若方程曲線未經過零點，則說明邊界擴散與粒子內擴散是主要的控速步驟[28]。如圖5-E所示，擬合為弱線性，因此整個過程分為3個階段，這表明樹脂XAD-7HP吸附抗菌肽可能包含多個過程：第1階段(0～30 min)屬于邊界層擴散，第2階段(30～60 min)描述了吸附過程中顆粒內擴散速率加快的過程，第3階段(>60 min)屬于最終平衡階段。擬合直線沒有經過原點(R2=0.90)，說明邊界層擴散與顆粒內擴散是主要的控速步驟[29]。

3 結論

通過吸附-解吸附實驗從8種大孔樹脂中篩選了可高效提取brevilaterin的大孔樹脂XAD-7HP，經過pH、溫度、乙醇濃度等關鍵工藝條件優化，brevilaterin的回收率達到82%。吸附等溫線方程顯示樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin與Langmuir和Freundlich模型擬合較好，吸附動力學研究顯示吸附過程符合擬二級動力學模型，因此推測XAD-7HP對brevilaterin的吸附屬于單分子層的化學吸附；Elovich方程擬合結果表明吸附過程主要分為3個階段：邊界層擴散、顆粒內擴散、最終平衡。總之，大孔樹脂XAD-7HP可以通過單分子層化學吸附方式提取brevilaterin，該工藝綠色環保、提取效率高，具有較高的工業化生產潛力。

表3 大孔樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin的動力學參數

A-動力學時間吸附曲線；B-擬一級動力學擬合結果；C-擬二級動力學擬合結果；D-Elovich方程擬合結果；E-粒子擴散方程擬合結果