霉菌發酵劑對干發酵香腸的理化指標、氧化程度及風味的影響

蔡嘉銘，王際輝，陶冶，肖珊，劉冰南，王亮

(大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連，116034)

傳統干發酵香腸主要以自然發酵為主，存在很多食品安全隱患，具有較大的不可控性。將微生物進行純培養作為發酵劑用于香腸的發酵，避免了許多不可控性，在很大程度上提高了食品安全性。微生物作為肉制品發酵劑已被廣泛應用，其中酵母菌和乳酸菌為最常用發酵劑[1]，酵母菌可以促進發酵肉制品顏色及風味的形成，抑制產品酸敗，加速發酵香腸中脂肪和蛋白質的降解，縮短發酵時間而提高產品品質[2]。乳酸菌獨特的產酸性能可以降低肉制品中的pH，對發酵肉制品中的腐敗菌有抑制作用，同時產生乙酸和乳酸等揮發性風味物質，能夠改善風味[3]。而霉菌廣泛作用于干腌火腿、奶酪、豆醬等食品加工與發酵過程中，起到極強的發酵作用。從干腌火腿中篩選的霉菌通常具有高酶活、抑菌等特點，對于干腌火腿特征性風味物質形成及品質形成等具有較大的作用[4]。另外因霉菌的大量存在起到隔氧的作用, 可防止產品酸敗[5]。國外的干發酵香腸，例如意大利色拉米、匈牙利色拉米的制備過程中都要有霉菌參與，可使產品具有特殊的氣味與外觀[6]。目前國內對于霉菌作為單發酵劑的研究極少，但霉菌對于食品發酵起到的重要作用值得探究與應用。

本文通過將干腌火腿中分離的高酶活無毒霉菌作為發酵劑接種于干發酵香腸中，通過對干發酵香腸理化指標、氧化程度以及風味進行測定，探究霉菌對干發酵香腸的發酵作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)P27從發酵成熟16個月的宣威火腿中篩選得來，具有較高的脂肪酶和蛋白酶活力，而且不產毒素，菌株通過固體培養后洗滌孢子懸液以備使用。

1.1.2 主要實驗試劑

三氯乙酸、TBA、EGTA、焦磷酸鈉、DNPH、乙酸乙酯、鹽酸胍、KH2PO4等，國藥化學試劑有限公司；鹽酸、乙醇，北京化工廠。

1.2 主要儀器與設備

DNP-9082恒溫培養箱，上海精密實驗設備有限公司；Agilent 7890A型氣相、5975C型質譜聯用儀，美國安捷倫科技有限公司; H2050R-1高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；U-5100分光光度計，日立公司；TA-XT plus質構儀，美國Stable Micro System公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 干發酵香腸制作工藝

原料為絞碎的豬肉(肥瘦質量比2∶8)100 g，加入食鹽2.8 g、糖1 g、白酒2 g、胡椒粉0.1 g、五香粉0.05 g、花椒粉0.05 g，攪拌均勻后加入枝孢菌孢子懸液，使最終濃度為106CFU/g，空白組不添加孢子懸液。4 ℃下將肉餡腌制10 h，洗滌腸衣后灌腸，25 ℃風干發酵。

1.3.2 干發酵香腸發酵過程中理化指標分析

選取發酵第0、5、10、20、30天干發酵香腸，每次取樣4根，用于指標的測定。

1.3.2.1 pH值測定

按照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》規定的方法進行測定[7]。

1.3.2.2 水分活度測定

將干發酵香腸剪碎，鋪滿測試杯底，用水分活度儀測定其水分活度。

1.3.2.3 細菌總數的測定

在超凈臺中切取9 g干發酵香腸，用無菌剪刀剪碎加入到90 mL無菌生理鹽水中，37 ℃搖瓶30 min得到干發酵香腸懸濁液，將懸濁液進行適當的稀釋，吸取1 mL稀釋液于PCA固體培養基中涂布，48 h后計數[8]。

1.3.2.4 質構的測定

將質構儀進行校正，設置參數，將香腸樣品放于平臺中心位置開始測定。測定參數如下：測前速度為2 mm/s，測試速度為1 mm/s，位移為10 mm，測試后速度為1 mm/s，負載類型為auto-5 g，下壓距離為樣品高度的50%，高度校正返回距離為30 mm，返回速度為15 mm/s，接觸力為5 g，探頭類型為P/50，數據收集率為200 pps，環境溫度為室溫。

1.3.3 干發酵香腸發酵過程中脂肪氧化程度的測定(TBARS)

參考MARCOS等[9]方法。將2.5 g剪碎的肉樣加入20 mL超純水，用IKA均漿器在均質3 min。取預冷的5 mL 250 g/L TCA溶液加入均質液中，在10 000×g、4 ℃條件下離心15 min，吸取上清液3.5 mL，加入1.5 mL 0.6%的TBA溶液，在4 ℃條件下攪拌15 min，之后在(70±2)℃條件下水浴30 min，冷卻后在532 nm波長處測定吸光度。2.5 mL超純水加1 mL 250 g/L TCA溶液和1.5 mL 6.0 g/L TBA溶液作空白。采用TEP作為標準液，通過標準曲線計算得到樣品中丙二醛的含量。

1.3.4 干發酵香腸發酵過程中蛋白質氧化的測定

1.3.4.1 蛋白質含量的測定

根據GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》測定肉樣的蛋白質濃度(c)[10]。

1.3.4.2 羰基含量的測定

參考LUND等[11]的方法對肉樣進行處理，得到樣品的吸光度和相應空白的吸光度，按公式(1)計算羰基含量：

(1)

式中：A1，樣品的吸光度；A0，空白的吸光度；c，蛋白質質量濃度,mg/mL。

1.3.5 揮發性物質的測定

通過固相微萃取結合氣質聯用技術對揮發性物質進行分析，利用DVE/CAR/PDMS材質萃取頭萃取風味物質，在250 ℃進樣口解析5 min。采用石英毛細柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；升溫程序：初始溫度40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至180 ℃，然后以10 ℃/min升至250 ℃。進樣方式：不分流進樣。質譜條件：離子源溫度：230 ℃；接口溫度：230 ℃；電離方式EI；電子能量70 eV；質量掃描范圍：40～300 amu。揮發性化合物的鑒定：將揮發性化合物的質譜信息與N1ST11質譜數據庫中標準化合物的質譜信息進行對比，以85%以上的匹配度確定化合物的名稱[12]。

1.4 數據處理與分析

每個樣品至少重復測定3次，采用Excel 2010進行數據處理，結果表示為平均數±標準偏差，用Origin 2017繪圖，通過SPSS 17.0軟件對數據進行方差顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 干發酵香腸發酵過程中理化指標的變化

在發酵的第0、5、10、20、30天取樣，測定干發酵香腸的理化指標。由表1所示，隨著發酵時間的增加，pH和水分活度逐步下降，空白組與接菌組香腸的pH及水分活度差異不顯著，接菌組的水分活度略低于空白組。

由表1可知，隨著發酵時間的增加，細菌總數呈現直線上升的趨勢，而接菌組干發酵香腸在每個階段中細菌總數均少于空白組，說明枝孢菌作為優勢菌群可能會產生某些活性物質抑制了雜菌的生長，從而減緩了干發酵香腸的腐敗過程。

表1 不同發酵階段空白組與接菌組干發酵香腸的理化指標變化

注：數據為均值±標準差；在相同指標同一列中，在右上方標記“*”表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 干發酵香腸發酵過程中質構的變化

目前，發酵香腸生產中的一個重要問題是產品口感較干導致香腸難以咀嚼，因此發酵香腸的硬度、彈性和咀嚼性等作為考核指標，綜合評價發酵香腸的品質[13]。

由表2可知，隨著發酵時間的延長空白組的硬度、咀嚼性和膠著性呈先增高后降低的趨勢，接菌組硬度、咀嚼性和膠著性呈上升趨勢，兩組的彈性值呈現先增高后降低的趨勢，這是因為發酵時間增加導致香腸水分蒸發，香腸變干，同時微生物的作用使香腸的質構發生明顯地變化。

表2 不同發酵階段空白組與接菌組干發酵香腸質構的變化

發酵前期,枝孢菌在生長階段，各指標差異不顯著。發酵后期，空白組香腸的硬度、咀嚼性、膠著性顯著高于接菌組，而彈性略低于接菌組香腸，兩組的黏聚性與回復性差異不顯著。綜合而言，空白組香腸肉質過硬且難以咀嚼，而枝孢菌作為發酵劑使干發酵香腸硬度與咀嚼度降低，彈性增高，從而提高口感，因此接入枝孢菌作為發酵劑可在一定程度上改善干發酵香腸的質構。

2.3 干發酵香腸發酵過程中脂肪氧化程度的變化

采用硫代巴比妥酸反應法(thiobarbituric acid ractive substance, TBARS)值測定原理是根據食品中不飽和脂肪酸氧化分解而產生丙二醛，利用丙二醛含量對脂肪氧化的程度進行評價[14]。脂質氧化是干發酵香腸在發酵過程中形成特征風味的主要途徑，脂質氫過氧化物進一步氧化或降解產生的揮發性化合物是形成風味的主要物質，但過度氧化的脂質易于產生酸敗味和哈喇味等不愉快的氣味。因此，控制脂質氧化程度對于產品的風味形成至關重要[15]。

由圖1可以看出,隨著發酵時間的延長，丙二醛含量逐步增加，這是由于發酵時間越長，香腸的脂肪氧化程度增強，生成了大量的揮發性成分，因此導致丙二醛含量增加[16]。其次，在每個發酵階段接菌組的丙二醛含量顯著低于空白組，說明枝孢菌P27可以減緩香腸的脂肪氧化，起到一定的抗氧化作用。

圖1 不同發酵階段空白組與接菌組干發酵香腸的脂肪氧化程度

2.4 干發酵香腸發酵過程中蛋白質氧化程度的變化

蛋白質氧化的主要產物之一為羰基化合物，可利用羰基含量表示蛋白質氧化的程度，羰基含量越高，蛋白質氧化程度越高[17]。發酵過程中蛋白質氧化反應的發生會影響肉制品的品質，同時一些必需氨基酸被氧化破壞后導致肉制品營養價值降低，羰基化合物與非氧化賴氨酸的游離氨基反應形成亞胺鍵，導致聚集體的形成，降低蛋白質消化率[18]。

由圖2可以看出，隨著發酵時間的延長，羰基含量呈現逐漸上升的趨勢，在每一個發酵階段，接菌組的蛋白質氧化程度均低于空白組，枝孢菌P27減緩了香腸的蛋白質氧化，發酵中后期作用更加顯著。蛋白質氧化的變化趨勢與脂肪氧化的變化趨勢相一致，說明枝孢菌具有一定的抗氧化功能，可以減緩香腸的氧化程度。

圖2 不同發酵階段空白組與接菌組干發酵香腸的蛋白質氧化程度

2.5 干發酵香腸揮發性物質的變化

發酵香腸的風味物質主要包括醛類、酮類、酯類、酸類和萜類等[19]，這些物質混合形成香腸的特有風味，它們主要來源于香腸制作過程中所添加的香料及香腸發酵過程中碳水化合物代謝、蛋白質水解、脂肪水解和氧化過程[20]。本文通過氣質聯用儀分析發酵30 d后干發酵香腸揮發性物質的組成及變化情況，接菌組與空白組共檢測到23種化合物，主要的風味化合物為醇類、酯類、醛類、酚類和萜類。

發酵肉制品中酯類化合物的產生與底物(醇類與酸類)水平以及微生物的酯酶活性有關[21]，酯類具有水果香味和花香，并且它們的香氣閾值較低，對干發酵香腸的整體風味起到極其重要的作用[22]。由表3可知，酯類物質含量最高，共包括11種物質，接菌組干發酵香腸酯類物質含量明顯高于未接菌組。乙酯類化合物在酯類化合物中最為豐富，如乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯等，都是源于微生物的酯化作用[23]。乙酸乙酯呈現清香、微帶果香的酒香，丁酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯具有甜果香，有菠蘿、香蕉、蘋果芳香，己酸乙酯具有曲香、菠蘿香型的香氣，可用于配制煙草香精以及曲酒調香[24-25]。接菌組產生特有酯類風味物質為苯丙酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯，而3-苯丙酸乙酯會呈現甜的水果或蜂蜜的花香香氣，2-甲基丁酸乙酯為水果型香精，兩者均已規定為可使用的食品用香料[26]。空白組產生的辛酸乙酯具有酒香，可能來源于制作中添加的白酒物質，也可能來源于自然菌群發酵。

表3 發酵30 d的空白組與接菌組干發酵香腸的風味物質含量

醇類物質主要來源為香腸配料中的白酒，盡管研究認為醇類物質對香腸的風味貢獻較小[27]，但它在微生物的作用下可以產生酯類物質[28]，因此醇類也是必不可少的風味物質。

醛類化合物是肉制品風味成分中十分重要的風味物質，主要來源于脂肪氧化，其風味閾值較低，對肉制品的風味貢獻較大[29]，但過度的脂肪氧化容易產生不愉快氣味。由于接菌組的氧化程度低于空白組，通過表3中可看出枝孢菌降低了干發酵香腸中醛類物質的含量。

在接菌組干發酵香腸中檢測到的少量萜類化合物如β-水芹烯、對傘花烴和D-檸檬烯，均在食品香料領域有所應用[30]。此外，接菌組檢測到多種獨特的風味物質，其中3-羥基丁酮具有特有的奶油香味，自然存在于玉米、奶酪和肉制品中，多用于干酪、咖啡、堅果的香味增強劑，同時也可用于配制奶油、乳品、酸乳和草莓型香精等[31]。

總體而言，枝孢菌使干發酵香腸中“有益”風味物質含量增高，并且產生了特有的風味物質使干發酵香腸風味更豐富，提高干發酵香腸的風味品質。

3 結論

接種枝孢菌后抑制了干發酵香腸雜菌的生長，改善了香腸的質構，且可顯著降低干發酵香腸脂肪和蛋白質氧化的程度。干發酵香腸的主要揮發性風味物質為酯類和醇類，接菌后增加了干發酵香腸酯類、醇類和烷類物質等含量，使得干發酵香腸的風味物質更加豐富。綜上所述，枝孢菌的接入起到了防腐抗氧化的作用，可以在一定程度上豐富香腸的風味，未來可作為發酵劑用于干發酵香腸的生產中。