Thermobifida fusca麥芽三糖淀粉酶的重組表達及其在麥芽三糖制備中的應用

胡凡，宿玲恰，吳敬*

1(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

麥芽三糖淀粉酶(maltotriose-forming α-amylase，EC 3.2.1.11 6，AmyA)由基因tfa編碼，是一種GH13家族的糖苷水解酶。該酶以淀粉或糊精為底物，水解糖鏈中的α-(1→4)糖苷鍵，通過內切或外切作用產生麥芽三糖及少量副產物。麥芽三糖是由3個葡萄糖單元經α-(1→4)糖苷鍵連接而成的麥芽低聚糖，耐熱耐酸性能比蔗糖、葡萄糖好，不易發生美拉德反應，用于食品能很好地保護顏色[1]。此外，麥芽三糖滲透壓低，持水性和抗結晶性好。它還能促進人體對鈣的吸收以及人體有益菌的繁殖，防止蛋白質變性，抑制淀粉老化，是一種理想的保健食品原料[2-4]。

1978年，日本KATSUO首先發現鏈霉菌(Streptomycesgriseus)NA-468能產生一種淀粉酶水解可溶性淀粉產生大約55%的麥芽三糖[5]。隨后，國內外相繼研究了BacillussubtilisG3[6]、Microbacteriumimperiale[7]、ChloroflexusaurantiacusJ-10-F1[8]、Natronococcussp. Strain Ah-36[9]、Streptococcusbovis148[10]、ThermobifidafuscaNTU22[11]、Brachybacteriumsp. Strain LB25[12]、Sclerotiniasclerotiorum[13]、Endomycopsisfibuligera[14]、AspergillusnigerCBS513.88[15]等來源的麥芽三糖淀粉酶，其中部分麥芽三糖淀粉酶性質參見表1。

表1 不同物種來源麥芽三糖淀粉酶性質對照

注：“N.D.”表示未被檢測或鑒定；GenBank/簡稱一列中，“/”前代表GenBank accession number，“/”后表示酶的簡稱；除特殊文獻標注外，表格內容參看參考文獻一欄

在上述麥芽三糖淀粉酶中，MiAmyA(商品名為AMT 1.2L)目前只由日本Amano公司生產，該酶先后被日本TAKASAKI等[7]、中國吳春森等[16, 23]、徐貴華等[18]報道，其水解小麥淀粉制備麥芽三糖終產率為47.6%[18]，中國團隊對該酶的研究都是從Amano購買，這極大限制了國內麥芽三糖相關產業的發展。2008年，NORIYUKI等[12]將來源于Brachybacteriumsp. strain LB25的麥芽三糖淀粉酶作用于可溶性淀粉，麥芽三糖終產率為49.24%，但是該酶在40 ℃以上極不穩定，不利于工業應用。

本研究首次將ThermobifidafuscaNTU22來源的麥芽三糖淀粉酶(TfAmyA，編碼基因為Tftfa，NCBI登錄號ABF13430[20])在食品安全菌株[24]BacillussubtilisWS11中進行了分泌表達，并對重組酶進行了酶學定性，在此基礎上探究了制備麥芽三糖的工藝，為麥芽三糖淀粉酶的工業生產中打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

BacillussubtilisWS11[25]、EscherichiacoliJM109、pET-20b-Tftfa(本實驗室前期構建)、本實驗室改造的高效表達載體pHY300PLK(含有g4基因)[25]。

1.1.2 酶及主要試劑

限制性內切酶Q.cutXbaⅠ、Q.cutNotⅠ，寶生物工程(大連)有限公司；DNA聚合酶2×Phanta Max Master Mix、一步克隆試劑盒ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒，碧云天生物技術；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒TIANgel Midi Purification Kit，天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨、酵母粉，英國Oxiod；其他試劑均為國產分析純，購自國藥集團。普魯蘭酶粗酶液，實驗室制備并保存，酶活力為4 000 U/mL。

1.1.3 主要儀器

LS-B50L型立式圓形壓力蒸氣滅菌器，上海醫用核子儀器廠；SHA-1102C空氣恒溫搖床，上海精密儀器儀表有限公司；Agilent 1200高效液相色譜系統，美國Agilent公司；DYY-6C型核酸電泳儀，北京六一電泳儀廠：FE28-Standard pH計，瑞士Mettler-Toledo公司；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；電熱恒溫培養箱，上海醫療器械研究所；DKB-600A型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司；凝膠成像系統，Bio-Rad 公司；UV-1700紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司；HZ-9212SB恒溫水浴搖床，太倉市華利達實驗設備有限公司。

1.1.4 培養基

LB液體培養基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；氨芐青霉素(Amp 100 μg/mL)或者四環素20 μg/mL，固體培養基還應加上瓊脂粉15～20。

TB發酵培養基(g/L)：酵母粉24，蛋白胨12，KH2PO42.31，K2HPO412.54，甘油5；四環素終質量濃度為20 μg/mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計

依據載體pHY300PLK和Tftfa基因序列，設計以下引物(由5’→3’端，下劃線部分代表同源臂序列)：

pHY300PLK F1：AAGCTTGGTAATAAAAAAACACCTCCA

pHY300PLK R1：CATGGCTTCAGCACTCGCAG

1.2.2 PCR獲得載體和基因片段

分別以pHY300PLK-g4和pET-20b-Tftfa為模板，F1/R1、F2/R2為引物擴增pHY300PLK獲得載體片段(5856bp)和基因片段Tftfa(1812bp)。PCR體系如下：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板1 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR參數：94 ℃ 預變性 4 min；進入PCR循環：98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸6 min或2 min，30個循環；最后72 ℃ 10 min，4 ℃保溫[26]。瓊脂糖凝膠電泳后切割目的條帶進行膠回收，獲得純片段。

1.2.3 目的基因的連接及轉化

按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產物，并一步克隆試劑盒將基因和載體片段進行連接。連接產物轉化E.coliJM109，涂布Amp抗性LB固體培養基并于37 ℃培養10 h，挑取單菌落至Amp抗性LB液體培養基于37 ℃ 培養8～10 h后，收集菌體抽提質粒進行雙酶切，并送測序公司測序。測序正確的質粒電轉化表達宿主B.subtilisWS11，涂布四環素抗性LB固體培養基，于37 ℃培養12 h，挑取單菌落至四環素抗性LB液體培養基于37 ℃培養8～10 h后保存甘油菌B.subtilisWS11/pHY300PLK-Tftfa。

1.2.4 重組菌的搖瓶發酵及SDS-PAGE分析

取20 μL甘油管菌B.subtilisWS11/pHY300PLK-Tftfa接種至10 mL LB液體培養基(含10 μg/mL四環素)中，放置于37℃，200 r/min的恒溫搖床中培養8～10 h，取2.5 mL菌液轉接至50 mL TB液體培養基(含20 μg/mL四環素)中，先放置于37 ℃，200 r/min的恒溫搖床中培養2 h，然后將搖瓶轉移至33 ℃，200 r/min的恒溫搖床中培養48 h。發酵結束后，以8 000 r/min離心20 min收集上清液，即為粗酶液。取粗酶液進行SDS-PAGE分析。取甘油管菌B.subtilisWS11不添加四環素按上述方法進行搖瓶發酵，最終收集發酵上清液進行SDS-PAGE分析，條帶作為陰性對照。

1.2.5 重組酶TfAmyA的純化及蛋白濃度測定

由于蛋白末端已帶上His-Tag，故用鎳柱HisTrapTMHP 5 mL純化TfAmyA。結合緩沖液(A液)成分為：25 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 7.4，洗脫緩沖液(B液)成分含300 mmol/L咪唑的A液。用5%的B液洗去雜蛋白后，直接用100% B液洗脫，得到純化的TfAmyA，經SDS-PAGE驗證后，得到電泳純的單一條帶。本實驗采用Bradford法測定蛋白濃度[27]。

1.2.6 重組酶TfAmyA最適溫度及溫度穩定性測定

用50 mmol/L pH 5.5的PBS配制1%可溶性淀粉，將酶稀釋至適當倍數后，在40、45、50、55、60、65、70、75 ℃不同溫度下，按照DNS法[28]測算酶活力。將最高酶活力定義為100%，其余條件下酶活力折算為相對酶活力，繪制不同溫度下相對酶活力折線圖。在55 ℃下，將酶溫育不同時長，取樣進行酶活力測定，將初始酶活力定義為100%，其余時長酶活力折算為相對酶活力，按照時長-相對酶活力繪制折線圖。

1.2.7 重組酶TfAmyA最適pH及pH穩定性測定

用pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5的50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液和pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的50 mmol/L PBS配制1%可溶性淀粉，將酶稀釋至適當倍數后，在55 ℃下，按照DNS法[28]測算酶活力。在pH 6.0下，將酶溫育不同時長，取樣進行酶活力測定，將初始酶活定義為100%，其余時長酶活折算為相對酶活，按照時長-相對酶活力繪制折線圖。

1.2.8 重組酶TfAmyA活力測定

用50 mmol/L pH 6.0的PBS配制質量濃度1%的可溶性淀粉，將酶稀釋至適當倍數后，按照DNS法[28]測還原糖的量(以葡萄糖作為標準曲線)，計算出酶活力。酶活力定義為：每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶量計為1個酶活力單位。

1.2.9 制備麥芽三糖的反應條件優化

以15%的麥芽糊精(DE 5-7)為底物，用不同pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)的50 mmol/L的PBS溶解底物溶解底物，分別以不同麥芽三糖淀粉酶加酶量(0、15、30、45、60、75 U/g底物)添加至底物中，普魯蘭酶以不同加酶量(0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 U/g底物)添加至反應體系中置于轉速為150 r/min、不同溫度(40、45、50、55、60 ℃)的水浴搖床中，轉化不同時間。用HPLC檢測麥芽三糖生成量，每次控制單一變量，逐步優化。

2 結果與分析

2.1 重組菌B. subtilis WS11/pHY300PLK-Tftfa的構建

提取連接產物轉化E.coliJM109的質粒進行雙酶切，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳，發現除了未被切完的重組質粒外(7 638 bp)，還有2條明顯的分別對應載體和基因的5 190和2 448 bp(圖1)，表明重組質粒構建成功。將重組質粒轉化入表達宿主B.subtilisWS11，構建重組菌B.subtilisWS11/pHY300PLK-Tftfa。

M-DL10000 DNA Marker；1-重組質粒酶切條帶

2.2 TfAmyA的表達、純化及酶學性質分析

2.2.1 TfAmyA的表達

B.subtilisWS11及重組菌B.subtilisWS11/pHY300PLK-Tftfa經TB發酵48 h后，胞外上清SDS-PAGE結果見圖2。泳道2為陰性對照，泳道1的63.2 kDa處出現1條蛋白條帶，與TfAmyA理論相對分子質量吻合，測得胞外粗酶液的酶活為56.81 U/mL，說明TfAmyA在B.subtilisWS11中成功表達。

M-中分子量蛋白Marker；1-重組菌胞外上清液；2- B. subtilis WS11胞外上清液

2.2.2 TfAmyA的純化

采用鎳離子螯合層析的方法，得到純化的TfAmyA，經SDS-PAGE驗證后，得到電泳純的單一條帶(圖3)。

M-中分子量蛋白Marker；1-純化TfAmyA

純化過程參數見表2，純化倍數達到19.8倍，純酶的比活為412.2 U/mg。同一來源的TfAmyA在不同宿主里的比活力有差異，本研究在B.subtilisWS11中表達獲得的TfAmyA均高于文獻報道的以大腸桿菌、畢赤酵母及耶氏解脂酵母為宿主菌的TfAmyA比活力(表1)。

表2 重組TfAmyA純化過程參數

注：粗酶液的純化倍數與回收率分別按照1和100%表示

2.2.3 TfAmyA的酶學性質分析

2.2.3.1 TfAmyA的最適溫度及溫度穩定性

溫度影響酶的三維結構、分子熱運動[29-31]，進而能影響酶促反應的催化速率。從圖4可以看出，TfAmyA的最適溫度為55 ℃。在40～55 ℃之間，酶活力有40%以上，且隨溫度提高而提高；在55～65 ℃之間，TfAmyA能維持90%以上的酶活力，在溫度>65 ℃時，酶活力迅速降低。這說明，溫度對酶活的影響很大。此外，由圖5可以看出，在55 ℃溫育時，TfAmyA在初始時酶活力最高，隨后基本呈現降低趨勢。到達195 h，酶活力才降至50%以下，穩定性相比于報道的S.fibuligera[14]、B.subtilisG3[6]、Brachybacteriumsp. Strain LB25[32]、S.griseusNBRC13350[33]、S.avermitilisNBRC14893[33]、Kitasatosporasp. MK-1785[34]以及M.imperiale[7]麥芽三糖淀粉酶要好。

圖4 重組TfAmyA的最適酶活力溫度

2.2.3.2 TfAmyA的最適pH及pH穩定性

pH影響酶的解離狀態，能影響酶促反應的催化速率[35]。從圖6可以看出，TfAmyA的最適pH為6.0，與來自Kitasatosporasp. MK-1785[34]、M.thermotoleransDAU221[19]的麥芽三糖淀粉酶一致。當pH在5.5～6.5之間，能保持80%以上的酶活力，超出該范圍，酶活力迅速降低。在pH 6.0下測量酶的pH穩定性。由圖7可以看出，酶在初始時酶活最高，隨后持續降低，超過150 h，酶活力才衰減至50%以下，說明在pH 6.0下該酶穩定性很好。

圖5 重組TfAmyA的溫度穩定性

圖6 重組TfAmyA的最適pH

圖7 重組TfAmyA的pH穩定性

2.3 重組麥芽三糖淀粉酶制備麥芽三糖工藝優化

2.3.1 麥芽三糖淀粉酶加酶量對麥芽三糖轉化率的影響

TfAmyA是一種內切型α-淀粉酶，其作用于麥芽糊精(DE 5-7)能產生以麥芽三糖為主的低聚混合物[20-22]。在加酶量過少時，底物需要長時間反應。增大加酶量，當其達到一定值后，酶轉化速率達到飽和，甚至還會水解麥芽三糖[14]，降低轉化率。從圖8可以看出，當加酶量為60 U/g底物時，轉化率達到最大,為38.8%。繼續增大加酶量，則會降低轉化率，與S.fibuligera[14]、S.griseus[36]來源的麥芽三糖淀粉酶相似，TfAmyA會微弱水解麥芽三糖。

圖8 催化制備麥芽三糖的TfAmyA加酶量優化

2.3.2 普魯蘭酶加酶量對麥芽三糖轉化率的影響

淀粉或糊精分子的α-(1→6)糖苷鍵會影響麥芽三糖淀粉酶對其水解作用。因此添加普魯蘭酶，使其與麥芽三糖淀粉酶協同作用，具有提高轉化率的實際意義[16, 25, 37]。從圖9中可以發現，當加酶量逐步增大時，轉化率也逐漸增大，但超過32 U/g底物時，轉化率不再增大。因此，最優加酶量為32 U/g底物，此時轉化率為41.1%。

圖9 催化制備麥芽三糖的普魯蘭酶加酶量優化

2.3.3 溫度對麥芽三糖轉化率的影響

溫度不僅影響底物的物理狀態，還會影響酶活力和半衰期。在上述最優條件基礎上，對反應溫度進行優化。從圖10可知，溫度對TfAmyA的催化作用影響較大，酶的最適溫度也是酶轉化最優溫度。低于55 ℃時，酶催化轉化率隨著溫度提高而提高，55 ℃達到最大，為41.1%。當反應溫度繼續增大時，酶的穩定性降低，轉化率下降。

2.3.4 pH對麥芽三糖轉化率的影響

pH影響酶的電解狀態，進而會影響酶活力及穩定性，從而會影響到酶轉化的效果[34-35, 38]，因此實驗探究了不同初始pH對轉化率的影響。圖11中值得關注的是，與酶活力最高的pH不同，酶轉化的最適pH是5.5。在初始反應pH<5.5時，轉化率隨pH提高而提高，在pH 5.5時達到最大，此時轉化率為42.3%，當pH繼續提高時，轉化率會逐漸下降。因此，后續反應采用pH 5.5的條件。

圖10 催化制備麥芽三糖的溫度優化

圖11 催化制備麥芽三糖的初始pH優化

2.3.5 反應時間對麥芽三糖轉化率的影響

反應時間增長時會導致酶活力略微下降，同時TfAmyA也會繼續水解麥芽三糖，從而降低轉化率[14, 36]。從圖12可知，在反應時間達到11 h之前，轉化率隨反應時間增長而增大，11～14 h之間，轉化率基本不變。綜合考慮，選擇11 h作為最優酶轉化時長，此時轉化率為44.4%。

圖12 催化制備麥芽三糖的反應時間優化

從表1可看出，相比于BbAmyA的轉化率49.24%與MiAmyA的轉化率47.6%，TfAmyA的轉化率要偏低，但是BbAmyA最適溫度低且溫度穩定性差，底物濃度也偏低，而MiAmyA相關信息被商業壟斷，這2種酶顯然不適于現在的淀粉糖工業。目前報道的部分其他來源的AmyA的轉化率、比活力都不如TfAmyA， 55 ℃下穩定的TfAmyA將更適于工業應用。

3 結語

目前制備麥芽三糖的方法主要分為2種，一種是利用普魯蘭酶水解普魯蘭多糖獲得，以此法得到的麥芽三糖雖然純度高，但限于普魯蘭多糖的生產成本，不適合用于食品原料的制備；另一種是通過AmyA水解淀粉原料而獲得[2]。

本研究首次將ThermobifidafuscaNTU22來源的麥芽三糖淀粉酶在BacillussubtilisWS11中進行了重組表達。重組菌在TB培養基中發酵48 h，胞外酶活達到56.81 U/mL。純化后，比活達到412.2 U/mg，比目前所知的其他來源AmyA及同源異種表達TfAmyA的比活力都要高。在此基礎上探究了制備麥芽三糖的工藝。利用TfAmyA對麥芽糊精(DE 5-7)進行酶轉化實驗。結果表明，當麥芽糊精的質量濃度為15%，溫度為55 ℃，pH 5.5，TfAmyA加酶量為60 U/g底物，普魯蘭酶加酶量為32 U/g底物，反應11 h時，轉化率最高達到44.4%。TfAmyA在一定程度上避免了麥芽三糖淀粉酶的熱不穩定及商業壟斷性，后續實驗可以從培養基的發酵優化、不同類型或不同質量濃度淀粉底物、分子改造提高酶催化產物專一性等方面優化麥芽三糖淀粉酶制備麥芽三糖的工藝，為其在食品行業的應用提供借鑒意義。