大腸桿菌分泌表達裂解性多糖單加氧酶發酵條件的優化

郭宵,安亞靜,柴成程,路福平,劉夫鋒

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

木質纖維素類生物質是地球上含量最豐富的可再生資源，包括纖維素(40%～50%)、半纖維素(20%～40%)和木質素(20%～30%)，在能源轉化方面具有廣泛的應用前景。纖維素是木質纖維素中含量最多的組分，通過降解后可以生成不同的寡糖，其中可發酵糖可以發酵生成乙醇，緩解石油資源緊張這一現狀[1-3]。在一般情況下，纖維素以不溶的晶體狀態存在于自然界中。但是目前存在纖維素酶對晶體狀態的纖維素降解效率較低的問題[4-8]。然而最近發現了一種裂解性多糖單加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases， LPMOs)可以降解晶體狀態的纖維素[9]。LPMOs是一種銅離子依賴型的氧化酶，可以通過氧化斷裂糖苷鍵的方式降解晶體纖維素[9-11]。而且研究表明，當LPMOs與纖維素酶協同作用時，可以顯著提高對纖維素的水解效率[10, 12]。

根據LPMOs的序列相似性可將其分為7個家族，分別為AA9-AA11[13-15]和AA13-AA16[16-19]。其中AA9家族主要降解纖維素，由于纖維素是木質纖維素中含量最豐富的組分，因此AA9家族是轉化木質纖維素生物質為生物燃料的關鍵[10, 20]。其中來源于真菌嗜熱毀絲霉(MyceliophthorathermophileC1)的MtC1LPMO (GenBank: AKO82493.1)蛋白，以C1和C4兩種氧化方式斷裂纖維素的糖苷鍵，同時纖維素存在時，可以斷裂木聚糖的糖苷鍵[21]。因為木聚糖是半纖維素的組成部分，而半纖維素是木質纖維素的重要組分[22]。半纖維素包裹著纖維素極大地阻礙了工業酶制劑對纖維素的降解。因此，對半纖維素的降解也是高效利用生物質的關鍵。

MtC1LPMO在生物質轉化過程中具有重要的作用，這類酶價值高且需求量較大，因此異源表達是一種非常有效的供應手段。大腸桿菌作為人們研究的最深入的微生物之一，是生產重組蛋白最常用的宿主，為許多外源蛋白提供了最經濟快速的表達系統[23-25]。但是大腸桿菌中表達的蛋白質常常在細胞質中以包涵體的形式積累[25-27]。因此，不同的信號肽被廣泛用于將外源蛋白輸出到大腸桿菌胞質空間或者直接分泌到胞外培養基中[26, 28]。如來源于蘇云金芽孢桿菌的BtLPMO10A利用載體自身信號肽實現了在大腸桿菌胞內的可溶性表達[29]；來源于粘質沙雷氏菌的CBP21(LPMO10)通過不同的信號肽嘗試，最終實現了在大腸桿菌的胞外表達[30]。但是目前利用大腸桿菌分泌表達真菌來源LPMO的相關研究較少。實現重組蛋白在大腸桿菌中的胞外表達，可以簡化下游處理工藝，因此酶的胞外表達可以降低工業生產的成本，提高工業應用的經濟效益。

為了進一步研究MtC1LPMO，該研究利用大腸桿菌將MtC1LPMO進行異源表達，實現MtC1LPMO在大腸桿菌中的分泌表達，提高了可溶性目標蛋白的總含量。最后通過優化培養條件和誘導參數來獲得MtC1LPMO在大腸桿菌的最大化生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌JM109、BL21(DE3)，pET22b表達載體質粒保存于本實驗室；高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性內切酶NdeI、XhoI均購自大連寶生物公司；質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購自北京索來寶科技有限公司；2,6-二甲氧基苯酚購自上海源葉生物科技有限公司。其他未注明試劑均為分析純，購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ZXGP-B2080隔水恒溫箱、ZHJH-C1106C超凈工作臺,上海智城分析儀器制造有限公司；Mastercycler nexus PCR儀,德國eppendorf公司；Multifuge X1R高速冷凍離心機、NanoDrop 2000蛋白核酸定量儀,美國ThermoFisher Scientific公司；可見分光光度計,上海精科實業有限公司。

1.3 pET22b-MtC1LPMO不同信號肽載體的構建

首先根據大腸桿菌宿主密碼子偏好性進行密碼子優化后合成MtC1LPMO基因，然后在C端添加(His)6標簽。根據2個不同的信號肽構建2個不同的載體，1個是MtC1LPMO基因本身的信號肽(MLTTTFALLTAALGVSA)，另1個是pET22b載體上的PelB信號肽(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA)。將MtC1LPMO成熟肽分別與2個不同的信號肽連接，然后插入到pET22b的NdeI 和XhoI 2個限制性酶切位點之間。最終經測序正確的質粒命名為pET22b-MtC1LPMO。

1.4 信號肽對MtC1LPMO表達的影響

構建好的pET22b-MtC1LPMO質粒轉入大腸桿菌EscherichiacoliBL21 (DE3)細胞中，然后在LB (lysogeny broth)瓊脂平板37 ℃培養過夜。挑取單克隆接入含氨芐霉素的5 mL的LB試管中培養12 h，然后以2%的接種量接種到含有氨芐霉素的LB培養基中進行發酵。當培養基OD600達到0.6時，添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)至終濃度為0.5 mmol/L，然后置于16 ℃發酵16 h或者30 ℃發酵4 h。發酵結束后，培養基和細胞在4 ℃通過8 000 r/min離心10 min進行分離，獲得的細胞重懸于裂解緩沖液buffer A (20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4, 20 mmol/L 咪唑, 500 mmol/L NaCl, 1 mmol/L DTT)。添加1%的溶菌酶后在冰上孵育30 min，然后通過超聲破碎(功率250 W，開啟2.5 s，關閉3 s，總時間15 min)將細胞進行裂解。上清和沉淀通過12 000 r/min離心30 min進行分離。測定不同組分中目標蛋白的含量及純度，分析不同信號肽對MtC1LPMO表達的影響。

1.5 重組MtC1LPMO表達條件優化

1.5.1 優化誘導時間

將含有PelB信號肽pET22b-MtC1LPMO重組質粒的大腸桿菌表達宿主E.coliBL21 (DE3)在LB培養基發酵。為了獲得種子培養基，挑取單菌落于5 mL的含有100 mg/L氨芐霉素的LB試管中220 r/min培養12 h。然后以2%的接種量分別接種到含有100 mg/L氨芐霉素的LB三角瓶培養基中于37 ℃進行發酵。當培養基OD600分別達到0.3、0.6、0.9、1.2和1.5時添加IPTG終濃度至0.5 mmol/L誘導重組MtC1LPMO表達。添加IPTG后將培養基置于30 ℃，200 r/min發酵4 h。發酵結束后，發酵液與細胞通過離心進行分離(8 000 r/min, 4 ℃, 10 min)。

1.5.2 優化IPTG誘導濃度

將上述的種子培養基以2%的接種量分別接種到含有100 mg/L氨芐霉素的LB三角瓶培養基中于37 ℃進行發酵。當培養基OD600達到0.9時，添加IPTG終濃度分別為0.05、0.1、0.25、0.5和1 mmol/L。然后將培養基置于30 ℃，200 r/min發酵4 h。發酵結束后，發酵液與細胞通過離心進行分離(8 000 r/min, 4 ℃, 10 min)。

1.5.3 優化誘導溫度及表達時間

將上述的種子培養基以2%的接種量分別接種到含有100 mg/L氨芐霉素的LB三角瓶培養基中于37 ℃進行發酵。當培養基OD600達到0.9時，添加IPTG終濃度為0.5 mmol/L，然后將培養基分別置于16、30、37 ℃下分別發酵4、8和16 h。發酵結束后，發酵液與細胞通過離心進行分離(8 000 r/min, 4 ℃, 10 min)。

1.5.4 優化乙醇濃度

將上述的種子培養基以2%的接種量分別接種到含有100 mg/L氨芐霉素的LB三角瓶培養基中于37 ℃進行發酵。當培養基OD600達到0.9時，添加IPTG終濃度為0.5 mmol/L，同時分別添加乙醇至最終體積分數為0%、1%、2%、3%、4%。然后將培養基在30 ℃下發酵16 h。發酵結束后，發酵液與細胞通過離心進行分離(8 000 r/min, 4 ℃, 10 min)。重組蛋白表達條件優化實驗重復了3次。

1.6 重組MtC1LPMO蛋白可溶性表達及純化

將上述收集的細胞重懸于裂解緩沖液buffer A。添加1%的溶菌酶后在冰上孵育30 min，然后通過超聲破碎將細胞進行裂解。上清和沉淀通過12 000 r/min離心30 min進行分離。

將收集的發酵液與細胞可溶性上清分別用0.22 μm濾膜(Millipore, Molsheim, France)過濾后，分別與Ni-NTA樹脂(Qiagen, Hilden, Germany)進行結合。結合之前樹脂用buffer A進行平衡。然后用清洗液buffer B (20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 500 mmol/L NaCl, 50 mmol/L咪唑, 1 mmol/L DTT)進行洗脫，最后用洗脫液buffer C (20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 500 mmol/L NaCl, 500 mmol/L 咪唑, 1 mmol/L DTT)洗脫帶(His)6標簽的重組蛋白MtC1LPMO。收集純化的蛋白溶液，用Nanodrop ND-2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific) 在280 nm下測定蛋白質濃度，用12%的蛋白膠進行SDS-PAGE分析蛋白的純度[31]，洗脫的蛋白用pH 6.0，20 mmol/L的磷酸緩沖液進行透析。

1.7 重組MtC1LPMO酶活力分析

酶活力測定基于2,6-二甲氧基苯酚(2,6-dimethoxyphenol: 2,6-DMP)和H2O2作為共底物[32]。1 mL 反應體系包含860 μL 116 mmol/L pH 7.5磷酸緩沖液，100 μL 10 mmol/L 2,6-DMP溶液，20 μL 5 mmol/L H2O2原液和20 μL純化的MtC1LPMO。酶活力在469 nm下測定反應300 s的前后吸光值的變化來計算，0.5 μM CuSO4作為空白對照。一個單位酶活力定義為反應條件下每分鐘生成1 μmol氧化產物[ε469= 53 200 (M·cm)-1。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建

由于不同的信號肽對蛋白的表達水平有不同的影響。因此，首先研究了2種不同信號肽對MtC1LPMO表達水平的影響。首先，利用SignalP 4.0[33]網頁分析了MtC1LPMO自身的信號肽為MLTTTFALLTAALGVSA，將其作為第1種信號肽構建至質粒中。第2個信號肽是PelB信號肽，其是CBP21 (LPMO10)在大腸桿菌中表達量最高的信號肽，氨基酸序列為MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA[30]。因此，選擇PelB信號肽構建到質粒中來表達MtC1LPMO，以期待提高重組MtC1LPMO的分泌表達水平。因此，以上述2種信號肽分別構建表達載體，質粒圖譜如圖1-A和圖1-B所示。

A-含有MtC1LPMO自身信號肽的表達載體; B-含有PelB信號肽的表達載體; C-PCR驗證結果; D-NdeI 和XhoI雙酶切驗證結果;M-1kb Marker; Lane 1-質粒pET22b-MtC1LPMO-1; Lane 2-質粒pET22b-MtC1LPMO-2

將重組質粒分別用PCR擴增和雙酶切鑒定，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1-C和圖1-D所示，2個質粒的PCR擴增條帶均為單一條帶，且NdeI 和XhoI雙酶切也出現正確的目標條帶。測序結果也進一步證實重組載體pET22b-MtC1LPMO構建成功。

2.2 不同信號肽對MtC1LPMO表達的影響

為了分析不同的信號肽及發酵溫度對重組MtC1LPMO表達水平的影響，將含有不同信號肽重組質粒的表達宿主分別在16 ℃發酵16 h或30 ℃發酵4 h表達目標蛋白。結果如圖2所示，SDS-PAGE結果顯示目標蛋白主要存在于包涵體中(圖2，泳道6)，發酵液和細胞中的可溶性MtC1LPMO比較少。

A, B-MtC1LPMO自身信號肽; C, D-PelB信號肽; A, C-16 ℃發酵; B, D-30 ℃發酵;M-標準蛋白; 條帶1, 3, 5-BL21原始菌發酵液，菌體上清，菌體沉淀; 條帶2, 4, 6-pET22b-MtC1LPMOBL21發酵液，菌體上清液，菌體沉淀

為了進一步獲得有活性的可溶性MtC1LPMO，將培養基發酵液與細胞可溶性上清中的目標蛋白利用Ni樹脂進行純化，然后利用SDS-PAGE進行蛋白純度檢測，結果如圖3所示。MtC1LPMO自身信號肽表達的蛋白只存在于細胞可溶性上清中(泳道2和4)，而PelB信號肽表達的蛋白存在于發酵液與細胞可溶性上清中(泳道5～8)，而且由于發酵液中雜蛋白比較少，所以純化得到的目標蛋白純度更高。測定不同體系的蛋白濃度，30 ℃下PelB信號肽表達的發酵液中(圖3，泳道7)的目標蛋白含量最高。此外，目標蛋白分泌到細胞外，工業應用中其下游處理則更為簡單，可以降低工業生產成本。因此在這種情況下，需要進一步優化E.coliBL21(pET22b-PelB-MtC1LPMO)的發酵條件，來獲得重組MtC1LPMO更高的總產量及細胞外比率。

條帶1～4-MtC1LPMO自身信號肽; 條帶5～8-PelB信號肽;M-標準蛋白;條帶1, 5-16 ℃發酵液; 條帶2, 6～16 ℃菌體上清液;條帶3,7～30 ℃發酵液;條帶4,8～30 ℃菌體上清液

2.3 發酵條件的優化

2.3.1 優化誘導時間

添加誘導劑的時間一般在菌體生長的對數前期或中期[34]，為了選擇合適的誘導時間點，我們分別在培養基OD600分別達到0.3、0.6、0.9、1.2和 1.5時添加IPTG終濃度至0.5 mmol/L誘導重組蛋白MtC1LPMO的表達。然后將培養基在30 ℃，200 r/min發酵4 h。發酵結束后，測定培養基的菌體濃度(圖4-A)，然后分別純化發酵液與細胞可溶性上清中的目標蛋白，測定蛋白濃度(圖4-B)。由圖4-A可以看出，隨著誘導劑添加時的培養基OD600的增高，發酵結束后培養基OD600也是逐步增高。但是圖4-B可以看出，重組蛋白MtC1LPMO的總產量在OD600為0.9時達到最高，為7.46 mg/L，細胞內外的可溶性MtC1LPMO含量都得到了一定的提高。

2.3.2 優化IPTG濃度

由于pET22b的啟動子是誘導型的T7啟動子，因此IPTG誘導濃度也是影響重組蛋白產量的重要原因。為了得到合適的IPTG誘導濃度，我們在培養基OD600達到0.9時，添加IPTG終濃度分別為0.05、0.1、0.25、0.5 和 1 mmol/L。然后將培養基置于30 ℃，200 r/min發酵4 h。然后測定培養基的菌體濃度(圖5-A)，然后分別純化發酵液與細胞可溶性上清中的目標蛋白，測定蛋白濃度(圖5-B)。由圖5-A可以看出，隨著IPTG濃度的增高，發酵結束的培養基OD600逐漸降低，這是由于IPTG對細胞有一定的毒性[35-36]。由圖5-B可以看出，總可溶性蛋白產量在IPTG為0.5 mmol/L時達到最高，相比于其他IPTG濃度，細胞外比率也明顯提高，為51.93%。IPTG為1 mmol/L時總的可溶性蛋白產量下降可能是由于菌體的減少，或者高濃度誘導劑條件下形成更多錯誤折疊的包涵體。

A-發酵結束的菌體濃度; B-可溶性蛋白產量

A-發酵結束的菌體濃度; B-可溶性蛋白產量

2.3.3 優化誘導溫度及表達時間

為了確定合適的誘導溫度及表達重組蛋白的時間，當培養基在OD600達到0.9時，添加IPTG終濃度為0.5 mmol/L后，分別置于16、30、37 ℃下分別發酵4、8和16 h。發酵結束后分別測定培養基的菌體濃度(圖6-A)，然后分別純化發酵液與細胞可溶性上清中的目標蛋白，測定蛋白濃度(圖6-B)。由圖6-A可以看出，同一個的溫度下，菌體濃度和蛋白產量都隨著時間的增長而增高。但是不同的溫度差異明顯，其中30 ℃發酵16 h的菌體濃度和蛋白產量是所有優化方案中最高的，總可溶性蛋白產量為10.49 mg/L，其中分泌至細胞外的蛋白產量為6.51 mg/L，細胞外比率為62.00%。

A-發酵結束的菌體濃度; B-可溶性蛋白產量

2.3.4 氧化應激

利用乙醇氧化應激是以往研究中用于重組蛋白過表達的一種策略[37]。在本研究中，研究了不同體積分數的乙醇對可溶性重組蛋白產量的影響。在添加IPTG的同時分別在不同的培養基添加乙醇至終體積分數為0%、1%、2%、3%、4%。然后在上述最優條件下發酵，發酵結束后的菌體濃度隨著乙醇體積分數增高而降低(圖7-A)，總可溶性蛋白含量在添加乙醇終體積分數為2%時達到最高(圖7-B)，為12.65 mg/L，其中細胞外蛋白含量也達到了最高，為8.51 mg/L，細胞外比率為67.30%。當乙醇添加更高時蛋白產量的下降可能是由于高濃度乙醇抑制了菌體的生長，導致重組酶的產率下降。

A-發酵結束的菌體濃度; B-可溶性蛋白產量

2.4 MtC1LPMO酶活力分析

最終優化方案獲得的重組MtC1LPMO蛋白，用20 mmol/L, pH 6.0的磷酸緩沖液進行透析后凍干，然后在文獻描述的標準條件下測定酶活力[32]，即30 ℃，pH7.5條件下以2,6-DMP為底物測定其酶活力，經計算比活力為10.3 U/g。來源于粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa) 的NcLPMO9F在標準條件下以2,6-DMP為底物的比活力為2.2 U/g[32]。因此，在此標準反應條件下，MtC1LPMO的比活力是NcLPMO9F的4.68倍。

3 結論

本研究異源表達了來源于真菌嗜熱毀絲霉的MtC1LPMO，首先構建了不同信號肽的載體，確定了PelB信號肽可以分泌表達MtC1LPMO。為了獲得更多的胞外酶，對表達條件進行了優化，確定了E.coliBL21 (DE3)/ pET22b-PelB-MtC1LPMO菌株在37 ℃培養基OD600為0.9時添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG和終體積分數為2%的乙醇，然后30 ℃誘導16 h，重組蛋白的可溶性表達量最高，為12.65 mg/L，為優化前的2.05倍。且細胞外比率也達到最高，為67.30%，其比活力為10.3 U/g。