農家豆瓣醬細菌多樣性及其對品質影響的評價

崔夢君，張振東，萬舒曼，葛東穎，郭壯

(湖北文理學院 食品科學技術學院，鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽，441053)

豆瓣醬是我國傳統發酵調味品，色澤鮮艷，香氣濃郁，深受廣大消費者的喜愛[1]。它的生產主要經過制曲、蠶豆發酵、辣椒發酵和混合發酵等過程[2]。發酵時，原料中的糖類和蛋白質等會被分解產生酸、醇和酯等物質，從而賦予豆瓣醬特殊的風味[3]。研究顯示，豆瓣醬中近40%的微生物為細菌[4]，細菌對與食品的發酵有著重要的作用[5]，因此對于豆瓣醬樣品細菌的研究就顯得尤為重要。目前，對于豆瓣醬的研究主要集中在菌株的分離鑒定[6]和生產工藝的優化[7]，而對于豆瓣醬中細菌多樣性和品質的研究相對較少。

隨著測序技術的快速發展，以Illumina MiSeq為代表的第二代測序技術能夠快速準確對發酵食品中的微生物進行解析[8-9]。目前，該技術已廣泛應用于白酒[10]和酸菜[11]等食品中微生物的解析；電子舌技術可以實現同時對食品中基本味和回味的相對強度進行測定，已廣泛應用于酸奶[12]和啤酒[13]等發酵食品的滋味品質評價；電子鼻技術可以對食品中特定的揮發性風味物質進行定性和定量分析，被廣泛應用于醬油[14]和蝦醬[15]等發酵食品中。

本研究從湖北省荊州市荊州區的農戶家中采集了13 個豆瓣醬，采用Illumina MiSeq測序平臺對農家豆瓣醬中細菌多樣性進行分析，同時采用電子舌和電子鼻技術對相關評價指標進行測定，并將細菌多樣性和豆瓣醬品質指標進行了相關性分析，最終對豆瓣醬中細菌的基因功能進行了預測，以期對后續農家豆瓣醬品質和食用安全性的提升提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農家豆瓣醬：采集至湖北省荊州市荊州區。

dNTPs Mix、FastPfuFly DNA Polymerase、5×TransStartTMFastPfuBuffer，北京全式金生物技術有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司；陰陽離子溶液、參比溶液和味覺標準溶液，日本Insent公司。

1.2 儀器與設備

Illumina MiSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計，美國Nano Drop公司；SA 402B電子舌，日本Insent公司；PEN3電子鼻，德國Airsense公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

于2018年10月上旬從湖北省荊州市荊州區郢城鎮和李埠鎮(E112°07′～112°22′，N30°32′～30°36′)農戶家中采集豆瓣醬樣品13 份。其制作時間約在70～80 d左右。

1.3.2 樣品微生物宏基因組DNA提取

取2.0 g豆瓣醬，按DNA基因組提取試劑盒說明書中進行DNA提取，并對其進行檢驗，將檢驗合格后的DNA樣品置于-20 ℃暫存備用。

1.3.3 細菌16S rRNA V4-V5區PCR擴增及測序

正反向引物分別為338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，參照郭壯的PCR擴增參數進行擴增[16]。將擴增后的DNA產物送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。測序主要流程如下：(1)文庫制備，對DNA進行片段化處理，并向兩端添加特定的接頭來構建測序文庫。接頭含有的互補序列使DNA片段結合到流動槽上，進行再擴增和片段純化。(2)測序，將文庫上樣到流動槽后置于測序儀中，擴增DNA片段簇。邊合成邊測序過程中，核苷酸通過天然的互補性與DNA模板鏈結合。每個核苷酸均含有熒光標記和可逆終止子，熒光信號可指示出加入的核苷酸種類，而終止子被切割后，下一個堿基繼續結合，讀取正向DNA鏈后，序列會脫落，隨后重復該過程，讀取反向鏈，最終完成測序過程。

1.3.4 生物信息學分析

使用QIIME(v1.70)平臺對質控后的有效序列進行細菌物種分析和多樣性評價[16]。使用GREENGENE數據庫對序列進行同源性比對，并對其分類學地位進行注釋，從而對豆瓣醬中細菌的基因功能進行PICRUSt預測[17]。

1.3.5 核酸登錄號

本研究中所有序列數據已提交至MG-RAST數據庫，登錄號為mgp89184。

1.3.6 基于電子舌技術對農家豆瓣醬滋味品質的評價

參考王玉榮等方法并做適當優化[18]。樣品處理：取10 g豆瓣醬樣品和90 mL蒸餾水混勻后10 000 r/min離心15 min，取上清液抽濾后置于4 ℃冰箱中24 h，去除上層油層后待用。數據處理：每個樣品重復測定4 次，取后3 次數據為有效數據。

1.3.7 基于電子鼻技術對農家豆瓣醬風味品質的評價

參考王玉榮等對鲊廣椒風味測定方法并做適當優化[19]。樣品處理：取10 g豆瓣醬樣品于電子鼻樣品瓶中，60 ℃保溫15 min，室溫靜置10 min后插入電子鼻測試電極進行測定，平行測定3 次。數據處理：響應曲線在60 s后達到穩定，選取63、64和65 s的響應值，并計算其平均值為測試值。

1.3.8 多元統計學分析

采用相關性分析法對平均相對含量大于0.5%的細菌屬與品質評價指標之間的相關性進行研究，選取相關系數絕對值大于0.5，且矯正后P<0.5的評價指標，采用Cytoscape軟件(v3.5.1)進行相關性網絡圖繪制；使用Pearson相關性分析法對豆瓣醬樣品中優勢細菌屬和COGs功能類別之間的相關性進行計算，并使用熱圖對結果進行可視化。使用R軟件(v3.3.2)進行相關性計算和作圖；使用Origin 8.5軟件(OriginLab Corp，MA，USA)進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術對農家豆瓣醬樣品中細菌多樣性進行了解析。16S rRNA測序結果及各分類學地位數量信息如表1所示。

表1 樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數量

由表1可知，高通量測序共產生了733 177 條高質量的16S rRNA序列，平均每個樣品56 398 條。按照100%和97%相似度對序列進行劃分且去除嵌合體后共得到了33 036 個OTU。DBJ8樣品的超1指數和香農指數均最大，分別為3 233和8.33。由此可見，DBJ8樣品細菌多樣性豐度和多樣性均最大。

2.2 農家豆瓣醬中細菌微生物的構成分析

在門水平上，樣品中的細菌隸屬于23 個門，其中硬壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的平均相對含量分別為61.92%、21.18%和11.98%。在屬水平上，共發現530 個細菌屬，優勢細菌屬(相對含量大于1.0%的細菌屬)相對含量比較分析如圖1所示。

由圖1可知，農家豆瓣醬中相對含量大于1.0%的細菌屬共有12 個，其中隸屬于硬壁菌門的有芽孢桿菌屬(Bacillus，20.69%)、葡萄球菌屬(Staphylococcus，20.50%)、片球菌屬(Pediococcus，7.09%)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus，6.30%)和四聯球菌屬(Tetragenococcus，1.17%)；隸屬于放線菌門的有棒狀桿菌(Corynebacterium，7.42%)、短桿菌屬(Brevibacterium，1.71%)和短狀桿菌屬(Brachybacterium，1.19%)，而隸屬于變形菌門(Proteobacteria)的有腸桿菌屬(Enterobacter，3.64%)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella，2.68%)、雷氏菌屬(Ralstonia，1.47%)、和沙門氏菌屬(Salmonella，1.03%)。由此可知，納入本研究的農家豆瓣醬中的細菌主要是由隸屬于硬壁菌門的優勢細菌屬構成，其平均含量累計為55.65%。值得一提的是，芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和乳酸桿菌屬在13 個樣本中均存在，其累計平均含量為47.49%。基于OTU的UpSet圖如圖2所示。

由圖2可知，DBJ5與其他樣品的獨有OTU數量最多為631 個，其次是DBJ2和DBJ7分別為546和524，分別占其豆瓣醬樣品OTU總數的56.95%、37.07%和35.77%。同時，DBJ1和DBJ13中有102個相同OTU，DBJ2和DBJ5中有58個相同OTU。由此可見，雖然不同農家豆瓣醬樣品中細菌屬的相對豐度存在著較大差異，但其細菌菌屬的種類卻有一定的相似趨勢，這也說明同一地區的豆瓣醬其菌群組成的相似性[20]。

圖1 農家豆瓣醬中優勢細菌屬相對含量的比較分析

圖2 基于OTU的UpSet圖

2.3 農家豆瓣醬優勢細菌屬及品質的相關性分析

本研究首先使用Illumina MiSeq高通量測序技術對農家豆瓣醬中細菌多樣性進行解析，再使用電子舌和電子鼻對其滋味和風味品質進行了評價，并構建了優勢細菌屬與品質指標相關性的網絡圖。農家豆瓣醬樣品各滋味指標相對強度的箱型圖如圖3所示。

圖3 農家豆瓣醬滋味指標相對強度值的箱形圖(n=13)

由圖3可知，農家豆瓣醬在酸味上的差異最大，其次是豐度(鮮的回味)、鮮味和咸味；而在后味B(苦的回味)、苦味和后味A(澀的回味)上的差異相對較小。由此可知，酸味、鮮味和咸味可能是導致農家豆瓣醬樣品滋味品質差異的主要指標。豆瓣醬風味指標強度如表2所示。

農家豆瓣醬樣品的整體風味品質差異主要集中在W1C、W5S、W2S和W1S等風味指標上。由此可知，不同的農家豆瓣醬其風味品質存在較大差異，且其風味品質的差異要大于滋味品質。因豆瓣醬的滋味和風味品質均受發酵菌群的影響[21],本研究對樣本中優勢細菌屬和感官指標間的相關性進行分析。

表2 農家豆瓣醬風味指標強度表(n=13)

由圖4可知，10 個品質評價指標與14 個優勢菌屬之間存在顯著相關性(|r|>0.5,P<0.05)。值得注意的是，僅Weissella(魏斯氏菌屬)和Citrobacter(枸櫞酸桿菌屬)與風味指標呈顯著正相關。鮮味、豐度、W1C、W3C和W5C均為豆瓣醬的優良型指標，而苦味、咸味、后味A和澀味則為缺陷型指標，由此可見，優勢細菌屬中魏斯氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬和假單胞菌屬(Pseudomonas)的增加，雷氏菌屬、鹽單胞菌屬(Halomonas)、棒狀桿菌(Corynebactenum)、短桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和沙門氏菌屬的降低，且根瘤菌屬和草螺菌屬等維持在一定比例均有助于提高農家豆瓣醬的產品品質。

圖4 農家豆瓣醬優勢細菌屬和感官指標相關性的網絡圖

2.4 基于多元統計學分析農家豆瓣醬細菌構成

本研究就樣品間的微生物群落結構進行研究。基于OTU水平進一步采用非加權的UniFrac距離主坐標分析和UPGMA聚類分析對13 個豆瓣醬樣品的β多樣性進行了研究，結果如圖5所示。

圖5 基于分類操作單元的非加權UniFrac距離的主坐標分析(A)和UPGMA聚類分析(B)

由圖5-A可知，13 個農家豆瓣醬樣品呈現出明顯的分類趨勢，編號為DBJ1、DBJ3、DBJ9和DBJ13的豆瓣醬分為一類，編號為DBJ4、DBJ6、DBJ8、DBJ10、DBJ11和DBJ12的豆瓣醬樣品分為一類。由圖5-B可知，13 個農家豆瓣醬樣品可分為2個聚類，其中聚類一由DBJ1、DBJ2、DBJ3、DBJ9和DBJ13構成，聚類二由其他樣品構成，兩者結果基本一致。由此說明，盡管納入本研究的農家豆瓣醬樣品中均存在大量的核心細菌菌群，但在不同的樣品間其微生物群落結構也存在較大的差異。以聚類分組為依據，對豆瓣醬樣品優勢細菌屬、滋味指標和風味指標進行Mann-Whiney檢驗發現，滋味和風味指標在兩者中均不存在顯著性差異，這可能是由于非加權UniFrac聚類分析未將菌群含量考慮在內，但在優勢細菌屬上面，芽孢桿菌屬、雷氏菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌和短狀桿菌屬均具有顯著性差異(P<0.05)，由此說明，樣品間的微生物群落結構存在較大的差異。

2.5 PICRUSt基因預測

本研究共計注釋到4195 COGs(蛋白質直系同源簇)，這些COGs分別屬于23 個功能大類。以聚類分組為依據，對功能大類進行Mann-Whiney檢驗，其顯著差異功能大類相對豐度的箱型圖如圖6所示。

A-RNA的加工和修飾；B-染色質結構和動力學；C-能量生產與轉換；G-碳水化合物的運輸和代謝；H-輔酶轉運和代謝；I-脂質轉運和代謝；M-細胞壁/膜/包膜生物生成；N-細胞運動；Q-次生代謝產物的生物合成，轉運和分解代謝；S-功能未知；U-細胞內運輸，分泌和囊泡運輸(下同)

由圖6可知，23 個功能大類中有10 個功能大類具有顯著性差異(P<0.05)，分別為A、B、C、G、H、I、M、N、Q和U。類別C、G、H、I、Q、U和M在所用樣品中占主導性地位。值得注意的是，聚類一中有更多的基因代表序列G和M，因此，聚類一中的細菌菌群對于碳水化合物的利用更加高效，細菌的生長也更加旺盛，更有利于豆瓣醬的發酵。COGs功能類群與優勢細菌屬之間的秩相關熱圖如圖7所示。

由圖7可知，納入本研究的農家豆瓣醬樣品中的優勢細菌屬與COGs功能類群之間存在著明顯的相關關系。其中細胞壁/膜/包膜生物生成與芽孢桿菌屬呈現極顯著正相關，而與葡萄球菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬和短狀桿菌屬呈現顯著負相關；碳水化合物的運輸和代謝與克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、沙門氏菌屬和片球菌屬呈現顯著正相關，而與短桿菌屬和短狀桿菌屬呈現顯著負相關。由此可見，克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、片球菌屬和芽孢桿菌屬對豆瓣醬發酵過程具有促進作用。但結合圖4的結論可知，其相對豐度過高易對豆瓣醬滋味和風味品質造成影響。

圖7 COGs功能類群與優勢細菌屬之間的秩相關熱圖

3 結論

本研究以荊州地區的農家豆瓣醬為研究對象，使用Illumina MiSeq高通量測序、電子舌和電子鼻技術相結合的方式對其細菌多樣性進行解析，同時探討細菌對豆瓣醬品質的影響。研究發現硬壁菌門、變形菌門和放線菌門的累計平均相對含量高達95.08%，而芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、片球菌屬和乳酸桿菌屬為其優勢細菌屬，相對含量占細菌總數的62%。納入本研究的農家豆瓣醬中雷氏菌屬、鹽單胞菌屬、棒狀桿菌、短桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和沙門氏菌屬的降低可以顯著改善豆瓣醬的品質。此外，優勢細菌屬在碳水化合物的運輸與代謝、能量生產與轉換、細胞壁/膜/包膜生物生成、輔酶轉運和代謝和脂質轉運和代謝等方面發揮著積極作用。