響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助雙水相提取牛蒡多糖及抗氧化分析

巫永華，陸文靜，劉夢(mèng)虎，張建萍，陳安徽，邵穎，王長(zhǎng)凱，劉恩岐

(徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州,221018)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡，農(nóng)副產(chǎn)品市場(chǎng)；聚乙二醇(分子質(zhì)量分別為2 000、4 000、6 000)、(NH4)2SO4、沒食子酸、蘆丁，上海源葉生物科技有限公司；DPPH，sigma公司；H2O2，Aladdin公司；溴化鉀(光譜純)，美國(guó)PIKE公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ3200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用有限公司；L550離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)Thermo fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡的預(yù)處理

篩選無腐爛發(fā)霉，表面顏色和形態(tài)正常的新鮮牛蒡，洗凈后用切菜機(jī)切成厚薄均勻的小片，置于50 ℃鼓風(fēng)干燥烘箱中烘干至水分含量<8%，烘干后用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩后裝在密封袋中，備用。

1.3.2 超聲波輔助雙水相提取牛蒡多糖的工藝研究

1.3.2.1 雙水相體系的確定

參考孫詩(shī)清等的方法[18]。稱取3種分子質(zhì)量的聚乙二醇各1.00 g，用純水溶解后，分別加入一定量的硫酸銨，使硫酸銨/聚乙二醇的質(zhì)量比為0.5∶1、1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1和3.0∶1，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，搖勻后轉(zhuǎn)入離心管中，漩渦振蕩均勻后于4 000 r/min離心10 min分相，分別測(cè)量上、下相的體積，計(jì)算相比并確定其與質(zhì)量比的關(guān)系。

在雙水相體系中加入一定的牛蒡粉，于50 ℃浸提3 h后超聲提取30 min，過濾，將濾液離心分相，吸取適量上、下相溶液，并以對(duì)應(yīng)的雙水相體系為參比，測(cè)定其多糖含量，計(jì)算牛蒡多糖在不同體系中的分配系數(shù)。

1.3.2.2 料液比對(duì)牛蒡多糖得率的影響

取1.5、2.0、3.0、4.5、6.0和7.5 g牛蒡粉末，分別加入雙水相體系中，在50 ℃中浸提3 h后超聲提取30 min，過濾，將濾液離心分相。吸取適量下相溶液，并以對(duì)應(yīng)的雙水相體系為參比，測(cè)定其多糖含量，計(jì)算牛蒡多糖的得率。

1.3.2.3 浸提溫度對(duì)牛蒡多糖得率的影響

稱取4.5 g牛蒡粉末加入雙水相體系中，分別在20、30、40、50、60和70 ℃中浸提3 h后超聲提取30 min，過濾，將濾液離心分相。吸取適量下相溶液，并以對(duì)應(yīng)的雙水相體系為參比，測(cè)定其多糖含量，計(jì)算牛蒡多糖的得率。

1.3.2.4 浸提時(shí)間對(duì)牛蒡多糖得率的影響

稱取4.5 g牛蒡粉末加入雙水相體系中，在50 ℃中分別浸提1、1.5、2.0、2.5、3、3.5和4 h后超聲提取30 min，過濾，將濾液離心分相。吸取適量下相溶液，并以對(duì)應(yīng)的雙水相體系為參比，測(cè)定其多糖含量，計(jì)算牛蒡多糖的得率。

1.3.2.5 超聲時(shí)間對(duì)牛蒡多糖得率的影響

稱取4.5 g牛蒡粉末加入雙水相體系中，在50 ℃恒溫水浴鍋中浸提2.5 h，依次超聲提取10、20、30、40、50和60 min，過濾，將濾液離心分相。吸取適量下相溶液，并以對(duì)應(yīng)的雙水相體系為參比，測(cè)定其多糖含量，計(jì)算牛蒡多糖的得率。

1.3.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以浸提時(shí)間(A)、浸提溫度(B)、超聲時(shí)間(C)、料液比(D)為自變量，牛蒡多糖得率為響應(yīng)值，按照Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，篩選出超聲輔助雙水相提取牛蒡多糖的最佳工藝參數(shù)，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.3.3 牛蒡多糖的制備

參考喻俊[11]報(bào)道的超聲法、賈小麗等[9]報(bào)道的熱水浸提法和高明俠等[10]報(bào)道的酶法以及采用本試驗(yàn)優(yōu)化得出的超聲波輔助雙水相法分別提取牛蒡多糖，分別經(jīng)Sevage法去蛋白3次后減壓蒸發(fā)至黏稠狀，加入適量的純水超聲復(fù)溶后離心，收集上清液，并加入無水乙醇至醇濃度達(dá)到80%，攪拌均勻，于4 ℃冰箱中醇沉12 h，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，依次經(jīng)乙醚和丙酮洗滌后，冷凍干燥，置于-20 ℃冰箱中保存待用。超聲法、熱水浸提法、酶法和超聲波輔助雙水相法制備的牛蒡多糖分別命名為UBPs、HBPs、EBPs和UATPBPs。

1.3.4 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[19]測(cè)定多糖含量。以D-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，在質(zhì)量濃度0.125～12.5 μg/mL范圍內(nèi)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程y=0.057 6x+0.096 8，R2=0.997 8，計(jì)算多糖的含量和提取率。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法[20]進(jìn)行測(cè)定。在質(zhì)量濃度1.67～15 μg/mL范圍內(nèi)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.021 2x-0.023 7，R2=0.997 8。

1.3.6 多酚含量的測(cè)定

以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalteu比色法[21]。在質(zhì)量濃度0.8 ～5.6 μg/mL范圍內(nèi)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所獲得的回歸方程為y=0.303 4x+0.145 1，R2=0.998 0。

1.3.7 黃酮含量的測(cè)定

黃酮含量的測(cè)定采用蘆丁法[22]。在質(zhì)量濃度7.5～60 μg/mL范圍內(nèi)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.008x+0.022，R2=0.996 6。

1.3.8 糖醛酸含量的測(cè)定

采用間羥基聯(lián)苯比色法[23]。在質(zhì)量濃度1～10 μg/mL范圍內(nèi)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.073 7x+0.015 6，R2=0.997 0。

1.3.9 牛蒡多糖抗氧化活性研究

參考王希等[24]報(bào)道的方法測(cè)定牛蒡多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力；參考闕斐等[25]報(bào)道的方法考察多糖對(duì)羥自由基的清除能力；參考CHOW等[26]的方法考察多糖的總還原能力。

1.3.10 牛蒡多糖的紅外光譜分析

冷凍干燥后的牛蒡多糖粉末，與光譜純KBr研磨混合后壓片，扣除空氣背景后用紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描，分別率為4 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助雙水相提取牛蒡多糖的條件確定

2.1.1 雙水相體系的確定

PEG/(NH4)2SO4雙水相相圖如圖1所示，其中曲線下方不分相，屬于單相區(qū)；曲線上的每一個(gè)點(diǎn)為臨界點(diǎn)；曲線上方為雙相區(qū)。在雙水相中，PEG大量存在于上相中，(NH4)2SO4大量存在于下相中。由圖1可知，當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低會(huì)導(dǎo)致不能分相，過高則會(huì)導(dǎo)致其析出。而(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，相對(duì)分子量越大的PEG，其分相時(shí)所需PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越小，雙水相體系越易形成。此相圖為PEG/(NH4)2SO4雙水相體系提取牛蒡多糖提供了理論依據(jù)。

圖1 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖

(NH4)2SO4/PEG不同質(zhì)量比對(duì)相比和牛蒡多糖分配效果的影響如圖2與3所示。

圖2 雙水相體系的分相結(jié)果

圖3 不同雙水相體系的分配系數(shù)

由雙水相體系的分相結(jié)果可知，在質(zhì)量比1.5∶1～4.5∶1時(shí)，3種聚乙二醇都具有很好的分相能力，并且相比隨著質(zhì)量比的增大而增大；而(NH4)2SO4對(duì)不同分子量PEG的相比差別影響不大，特別是在質(zhì)量比為3∶1時(shí)，基本無影響。但是3種聚乙二醇對(duì)牛蒡多糖的分配系數(shù)影響較大，其中PEG 6000的分配系數(shù)顯著高于PEG 2000的。綜合考慮，試驗(yàn)確定質(zhì)量比為3∶1的(NH4)2SO4/PEG 6000體系作為牛蒡多糖提取的最佳雙水相體系，試驗(yàn)結(jié)果與孫詩(shī)清等報(bào)道的結(jié)果相似[18]。

2.1.2 料液比的確定

如圖4所示，當(dāng)料液比(g∶mL)在0.010∶1～0.045∶1時(shí)，牛蒡多糖的得率隨料液比的增大而提高；而當(dāng)料液比(g∶mL)超過0.045∶1時(shí)，多糖的得率開始緩慢下降。說明隨著溶劑的增加，溶劑溶解雜質(zhì)增多，而多糖溶出已達(dá)到平衡。綜合考慮，選擇料液比(g∶mL)為0.045∶1進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖4 料液比對(duì)牛蒡多糖得率的影響

2.1.3 浸提溫度的確定

不同浸提溫度對(duì)多糖得率的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 浸提溫度對(duì)牛蒡多糖得率的影響

從圖5可以看出，當(dāng)浸提溫度小于50 ℃時(shí)，多糖得率隨著溫度的升高而顯著提高，而超過50 ℃后，多糖得率開始緩慢下降。由于溫度提高增加了多糖的溶解度，而溫度過高時(shí)，導(dǎo)致部分多糖分解，因此選擇浸提溫度為50 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，王全等[27]在優(yōu)化瑪咖多糖提取工藝時(shí)也得到了相似的結(jié)果。

2.1.4 浸提時(shí)間的確定

如圖6所示，在浸提時(shí)間小于2.5 h時(shí)，牛蒡多糖能夠充分溶解到雙水相系統(tǒng)中，因此多糖得率隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，并且在2.5 h達(dá)到最大，但是浸提時(shí)間超過2.5 h時(shí)，多糖得率緩慢下降，但不顯著。故選擇浸提時(shí)間為2.5 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖6 浸提時(shí)間對(duì)牛蒡多糖得率的影響

2.1.5 超聲時(shí)間的確定

如圖7所示，在30 min之內(nèi)，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，牛蒡多糖得率顯著增加，可能是由于超聲波的空穴效應(yīng)促進(jìn)溶質(zhì)的傳遞，加速了多糖的溶出；超過30 min后，多糖得率下降，是因?yàn)槎嗵侨艹雎蕼p小，同時(shí)超聲波會(huì)導(dǎo)致部分多糖降解。因此選擇超聲時(shí)間為30 min左右進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖7 超聲時(shí)間對(duì)牛蒡多糖得率的影響

2.1.6 響應(yīng)曲面優(yōu)化超聲輔助雙水相提取牛蒡多糖的試驗(yàn)結(jié)果

2.1.6.1 回歸模型分析

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

注：**為差異極顯著(P<0.01)；*為差異顯著(P<0.05)

2.1.6.2 響應(yīng)面交互作用分析

由圖8可知，等高線圖呈橢圓形且超聲時(shí)間軸向等高線比超聲功率軸向等高線密集，響應(yīng)面圖中超聲時(shí)間曲線較陡，說明C(超聲時(shí)間)對(duì)牛蒡多糖提取率的影響較大，AC之間的交互作用對(duì)牛蒡多糖提取率影響顯著。

圖8 超聲時(shí)間和浸提時(shí)間的響應(yīng)面和等高線圖

由圖9可知，響應(yīng)面圖中料液比和浸提溫度曲線都比較陡，而且BD的等高線呈橢圓形，說明B(浸提溫度)和D(料液比)對(duì)牛蒡粗多糖提取率都有較大的影響，BD之間的交互作用對(duì)牛蒡多糖提取率的影響顯著。

圖9 料液比和浸提溫度的響應(yīng)面和等高線圖

通過Design-Expert.V.8.0.5b軟件預(yù)測(cè)得到最佳條件為：浸提時(shí)間2.62 h,浸提溫度48.56 ℃，超聲時(shí)間30.89 min, 料液比0.04∶1(g∶mL)，牛蒡多糖提取率理論值為32.38%。根據(jù)最佳條件并考慮實(shí)際操作調(diào)整為料液比(g∶mL)0.04∶1，浸提溫度49 ℃，浸提時(shí)間2.6 h，超聲時(shí)間31 min，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，在該條件下牛蒡多糖的實(shí)際提取率為(32.35±0.85)%。與預(yù)測(cè)值相差不大，因此認(rèn)為優(yōu)化條件可信，說明用BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)來優(yōu)化超聲波輔助雙水相提取牛蒡多糖條件是可行的。

2.2 不同提取方法制備的牛蒡粗多糖提取率及主要成分比較

由表4可知，超聲波輔助雙水相法的提取率顯著高于其他3種方法(P<0.05)，其次為酶法提取的提取率，而熱水浸提法的提取率顯著低于其他方法，張倩等研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理能明顯提高枸杞多糖的提取率[28]；4種方法制備的粗多糖中，純度最高的是超聲波輔助雙水相法(P<0.05)。粗多糖中含有一定的多酚、黃酮和蛋白質(zhì)類物質(zhì)，這些成分可能是與糖類基團(tuán)緊密相連而在提取和醇沉過程中混入到樣品中[29]。UBPs和UATPBPs中的多酚、黃酮和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)要顯著高于其他方法(P<0.05)，可能是由于超聲波的空化、機(jī)械和熱效應(yīng)能更大強(qiáng)度的破壞牛蒡細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致更多的非多糖成分被釋放出來，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與蘇平等報(bào)道的一致[29]。酶法和熱水提取的粗多糖中糖醛酸含量高于其他兩者。4種粗多糖中蛋白質(zhì)含量都較少，說明Sevage法去蛋白效果較好。

表4 牛蒡粗多糖提取率及主要成分的含量

注：同一列中不同字母表示有顯著相關(guān)。

2.3 牛蒡多糖抗氧化能力測(cè)定的結(jié)果分析

由圖10～圖12和表5可知，4種方法制備的牛蒡多糖都具有較好的DPPH·、·OH的清除率和總還原能力，并且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出極好的量效關(guān)系，表明其牛蒡多糖具有較好的抗氧化活性，結(jié)果與喻俊等[32]、周濃等[8]的研究結(jié)論一致。

圖10 牛蒡多糖對(duì)DPPH·的清除率

圖11 牛蒡多糖對(duì)羥自由基的清除率

圖12 牛蒡多糖的總還原力

表5 牛蒡多糖的抗氧化能力分析[IC50值/(mg·mL-1)]

注：同一行中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)

總體而言，UATPBPs的抗氧化能力最好，其次是UBPs，二者都顯著高于EBPs和HBPs(P<0.05)。蘇平等[29]研究表明超聲輔助提取的黃秋葵花多糖的抗氧化能力要強(qiáng)于熱水、酸法和酶法所制備的多糖；LI等[33]研究顯示超聲提取的駿棗多糖的還原力高于熱水法提取的多糖；SHEN等[34]在研究不同提取方法對(duì)油茶餅多糖抗氧化能力的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)相較于酶法、堿法、熱水提取的多糖，超聲波所制備的多糖具有最強(qiáng)的還原能力；YAN等[35]研究表明超聲處理對(duì)多糖生物活性有一定的積極影響，能提高多糖的抗氧化活性；這些研究結(jié)果與本結(jié)論相似。研究表明，多糖的抗氧化活性與其分子質(zhì)量大小、糖醛酸含量、單糖組成和主鏈結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[36-37]，超聲處理過程中可能會(huì)使得更多的生物活性物質(zhì)溶出或者使多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的降解，相對(duì)分子質(zhì)量減小，更多的活性基團(tuán)暴露，使其抗氧化活性提高[38-40]。而試驗(yàn)中UATPBPs的抗氧化能力要高于UBPs，可能是由于超聲提取的時(shí)間太長(zhǎng)引起牛蒡多糖過度降解而引起的，具有原因有待進(jìn)一步研究。

2.4 牛蒡多糖的紅外光譜分析

圖13 UATPBPs的紅外光譜圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)探討響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助雙水相法提取牛蒡多糖。試驗(yàn)結(jié)果表明(NH4)2SO4/PEG 6000的質(zhì)量比為3∶1時(shí)，雙水相體系最佳，超聲波輔助雙水相提取牛蒡多糖的最佳條件為料液比(g∶mL)0.04∶1，在浸提溫度為49 ℃浸提2.6 h后，超聲處理31 min，牛蒡多糖的最大得率達(dá)到(32.35±0.85)%。比較超聲法、熱水浸提法、超聲波輔助雙水相法和酶法提取的牛蒡粗多糖的提取率、主要成分及抗氧化活性，結(jié)果表明UATPBPs的提取率和含量最高，4種粗多糖都含有一定的多酚、黃酮和糖醛酸，并含有少量的蛋白質(zhì)。紅外光譜分析表明牛蒡多糖為吡喃型多糖；抗氧化試驗(yàn)表明，4種方法制備的牛蒡粗多糖都具有較好的抗氧化性，并且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。其中，UATPBPs的抗氧化能力最好，對(duì)DPPH·、 ·OH清除率和還原能力的IC50值分別為0.619 9、2.900 8和1.187 1 mg/mL，提示超聲波輔助雙水相技術(shù)可以結(jié)合超聲波和雙水相技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，制備出具有較高生物活性的牛蒡多糖。不同提取方法制備的牛蒡多糖的抗氧化活性差異可能是由于提取技術(shù)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、分支度、相對(duì)分子質(zhì)量和立體構(gòu)象的影響而造成的[45]，下一步可探討不同提取方法對(duì)牛蒡多糖結(jié)構(gòu)、組成、分子量等的影響，并研究結(jié)構(gòu)與抗氧化等生物活性之間的關(guān)聯(lián)。