醬香型白酒大曲細菌菌群結構及功能研究進展

王小平，黃永光 *，周文美

（1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

酒曲起源于中國，被譽為中國第五大發明，曲乃酒之骨，曲的種類決定了酒的香型和風格，酒曲在白酒發酵過程中主要作為糖化發酵劑，提供微生物動力、酶動力和風味前體物，對白酒品質和風味提升尤為重要，因此就有了“醅作肉，水作血，曲為骨”的說法。中國酒曲的分類繁多，根據大曲在曲房中能達到的最高培養溫度，一般將大曲分為高溫曲、中溫曲和低溫曲。

高溫大曲是醬香白酒的糖化發酵劑，曲中風味前體物質和特有的微生物體系形成了醬香型白酒的特有風格：醬香突出、幽雅細膩、酒體醇厚、空杯留香持久。高溫大曲的制曲溫度最高可達60～70 ℃，使得大曲中霉菌和酵母數量減少，細菌數量相對增多。研究表明，細菌在高溫大曲中的作用主要是產香，是形成醬香型白酒典型香氣特性的主要菌群。因此，對醬香型大曲細菌菌群結構多樣性及其功能性進行研究，有助于提高對醬香型大曲的制曲機理的認識，從而對制曲過程進行調控，對大曲的品質以及醬香型白酒的品質提升具有重要作用。本文在前人研究的基礎上，對醬香型大曲細菌菌群結構多樣性及功能性的研究方法、研究結果進行歸納總結，以期對醬香型大曲中細菌的研究提供參考。

1 醬香型大曲細菌菌群結構多樣性

醬香型白酒釀造工藝獨特，整個生產周期需經歷二次投料，八輪次發酵，七次蒸酒，長期陳釀，精心勾兌而成[1]。其高溫制曲是醬香大曲制作的一大特色，其制作特點是水分多和溫度高，從而使在整個大曲制作過程中，細菌數量總體增加。霉菌與酵母由于受制曲環境的影響，使得兩者在大曲中的含量減少。由此可見，細菌在醬香型大曲中的作用至關重要，研究醬香大曲細菌菌群多樣性對于后期解析產醬香的獨特風味的作用機制提供理論基礎。而常用的研究方法主要包括：傳統可培養分離技術與免培養分離技術。這兩種分離技術的目的旨在解析大曲中的微生物菌群結構，都各有其獨特的特點，且具有互補的作用。

1.1 傳統可培養分離技術研究醬香型大曲細菌群落結構多樣性

1.1.1 傳統可培養分離技術

傳統可培養分離技術主要是將樣品中的微生物分離純化后，根據菌株的形態特征、生理生化特性或遺傳特性確定其種屬。在篩選過程中運用直接鏡檢法或平板培養菌落計數法對篩選出的目標菌株進行統計分析，由于固態基質對微生物細胞的吸附作用、固態基質顆粒對鏡檢的干擾使得直接鏡檢計數不完全；此外，平板菌落計數由于培養基、培養條件的差異也會造成微生物計數差異。雖然該技術在研究白酒微生物的結構多樣性及其數量變化中運用較為廣泛[2-3]，但是該方法耗時、耗力、分離不完全、易受人為因素的影響和環境條件的限制。研究表明，運用傳統可培養分離技術僅能分離出1%～5%的微生物[4]。因此，該技術對單一樣品中某類微生物進行針對性的篩選運用得較多，若要對整個樣品中的微生物結構多樣性進行分析，選用可培養分離技術不能達到此目的，還需借助新的技術方法和手段。

1.1.2 傳統可培養分離技術研究醬香型大曲細菌群落結構多樣性的現狀

近年研究發現，運用傳統可培養分離技術從醬香大曲中分離得到的多數是芽孢桿菌（Bacillus）群，具體研究情況見表1。

表1 傳統可培養分離技術研究細菌多樣性的現狀Table 1 Research status of bacterial diversity by traditional culture-dependent techniques

綜上所述，運用傳統可培養分離技術對醬香型大曲細菌群落結構多樣性進行研究，發現多數為耐高溫的芽孢桿菌屬、少數微球菌屬、葡萄球菌屬、費氏鏈霉菌屬等細菌類群。芽孢桿菌屬在醬香型大曲中的數量相對其他細菌屬較多，因為大多數芽孢桿菌能在高溫、高鹽、偏酸、高濕等貧瘠的環境中生長繁殖，代謝產生高溫蛋白酶、淀粉酶類，輔助霉菌降解大曲中的原料，并生成多種游離氨基酸，在發酵過程中形成一系列復雜反應，產生獨特的醬香風味。但是在制曲過程中可變因素很多，制曲環境、工藝參數等也會影響芽孢桿菌的種類，從而影響整個大曲中的細菌菌群。

1.2 免培養分離技術對醬香型大曲細菌群落結構多樣性研究

1.2.1 免培養分離技術

近年，免培養技術在研究濃香型、清香型白酒釀造過程中微生物結構多樣性方面的運用最為普遍，而對醬香型大曲、環境、酒醅等微生物多樣性的研究也慢慢興起。目前，在研究白酒釀造過程中微生物多樣性所運用的分子生物學方法主要有聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、高通量測序技術、克隆文庫法、熒光原位雜交法、限制性酶切片段長度多態性法、聚合酶鏈式反應-變性或溫度梯度凝膠電泳法（ploymerase chain reaction and denaturing/temperature gredient gel electrophoresis，PCR-DGGE/TGGE）等。為了擺脫傳統可培養分離技術的束縛，免培養技術能夠更客觀的探索樣品中的微生物結構且從遺傳特性上較客觀的分析樣品中的微生物群落，并能精確地揭示微生物種類和遺傳多樣性。本文基于近年運用免培養技術在醬香型大曲微生物群落結構多樣性的研究現狀，簡單的介紹了PCR-DGGE技術、高通量測序技術及16S rDNA克隆文庫技術的基本原理、特點及其技術手段。

（1）PCR-DGGE技術

DGGE在20世紀80年代初期由MYERS R M等[15-16]發明，主要用于檢測脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）片段中的點突變[15-16]。其基本原理基于一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳，在此基礎上，加入梯度變性劑，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區分開。

MUYZER G等[17]在1993年首次將PCR-DGGE技術應用于微生物群落結構研究。目前該技術已被廣泛應用于解析各生態系統中的細菌或古細菌、真菌群落結構多樣性[18]。該技術直接從樣品中抽提宏基因組，不需要進行培養，且能檢測到難以培養或不可培養的微生物[19]；其次，該技術檢測快速、精確、直觀。但是此方法只能分析500個堿基對以下的DNA片段，只有系統中1%以上的微生物種群能被檢測出，系統中的弱勢菌群不能或者難以被檢測到，且在PCR引物設計擴增某些特定菌群時，微生物群落結構組成會因為部分菌群序列間的同源性差異明顯使得群落組成結果被高估，同時，有些細菌具有多個拷貝的核糖體核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）操縱單元也會使得其群落組成被高估。

（2）高通量測序技術

高通量測序技術是在第一代測序技術（即Maxam-Gilbert和Sanger測序技術）的基礎上發展而來的[20]，其與傳統可培養技術相比能快速地進行序列分析，且分析的序列數量大、同時能檢測到一些弱勢菌群以及一些不可培養的微生物，使得檢測更為全面、精確度高、通量大。高通量測序技術流程包括樣品采集、核酸序列的提取及純化、文庫構建、測序、原始序列信息比對注釋、數據處理等[20-24]。高通量測序技術的基本原理基于其測序平臺的不同而有所差異，目前，運用的測序平臺主要有Roche 454焦磷酸測序平臺、Illumina測序平臺、SOLiD測序平臺、Ion Torrent測序平臺和PacBio SMRT測序平臺[25]。其中Roche 454和Illumina測序平臺在研究白酒釀造過程中微生物群落結構多樣性方面較為廣泛。

高通量測序所檢測到的原始序列需進行總體分析后再利用基因數據庫進行物種注釋，進一步確定其微生物分類學地位。常用的分析方法有聚類分析、判別分析、排序分析、相關性分析和差異性分析等[26]。近年來研究發現，在研究白酒釀造過程中微生物群落結構多樣性常用的數據分析方法有主成分分析（principal component analysis，PCA）、典型相關分析（canonical correlation analysis，CCA）及相對豐度熱圖。由于高通量測序所得到的測序數據量大從而限制研究者對其數據進行有效數據的篩選，其基因文庫的構建及測序方法也會因為引物退火溫度不當、模板DNA代表性不強等導致引入系統偏差和隨機性，從而使樣本中核酸分子含量與實際樣品含量有偏差。因此，對高通量測序技術所要達到的測序要求越來越高，即在降低成本的情況下達到對樣品中微生物群落結構多樣性更深入、更精確、更全面的分析與研究。

（3）16S rDNA克隆文庫技術

16S r DNA 克隆文庫技術是直接從分子水平上研究微生物的結構，在解析復雜環境微生物群落結構中能更可靠、更直接的反應細菌群落的構成及多樣性。其基本原理是基于微生物群落16S rRNA基因片段的克隆表達構建文庫，從而推測樣品中微生物的分類學地位，該技術成熟，便于操作。但是因為其操作步驟較為繁瑣，工作量較大，導致獲得的能夠反映微生物宏基因組的信息量較為局限，主要以優勢菌群為主，從而出現物種豐度被高估以及微生物群落大小與多樣性的可能性被低估[27]。如若只解析樣品中微生物群落的優勢菌群，選用此技術能夠很好地達到此目的。

1.2.2 免培養分離技術研究醬香型大曲細菌群落結構多樣性的現狀

隨著現代分子生物學不斷發展，免培養分離技術被廣泛運用到菌種鑒定中。與傳統可培養相比，免培養分離技術能夠快速、精確地鑒定出微生物，同時能夠發現新的微生物種類。目前，運用免培養分離技術分析白酒釀造過程中的細菌群落結構多樣性多見于濃香型白酒，而對醬香型白酒釀造過程中細菌菌群的研究較少，多見于酒醅、堆積、窖池中微生物菌群的研究。黃蘊利等[28]運用高通量測序技術從醬香型白酒第二輪次酒堆積過程中共檢測到細菌屬138個；窖池發酵過程中共檢測到細菌屬262個。郭敏等[29]同樣運用高通量測序技術從醬香型白酒3輪次酒醅中檢測到特有細菌屬9個，而從7輪次酒醅中檢測到特有細菌屬8個。采用免培養分離技術對醬香型大曲細菌菌群結構研究的現狀見表2。

以上研究表明，從醬香型大曲中主要檢測到厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、藍藻門、梭桿菌門、擬桿菌門等的細菌屬，其中厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門在醬香大曲中占主導地位。其次，免培養分離技術還檢測到Uncultured Propionibacteriaceae bacterium、UnculturedWeissellasp.、UnculturedCyanobacterium等不可培養的細菌菌群以及棒狀桿菌屬、魏斯氏菌屬等稀有細菌屬。與傳統可培養相比，更能全面地分析醬香大曲細菌多樣性。但是在研究大曲中微生物的功能屬性時，還需借助可培養技術。兩種技術聯用互補對解析微生物的結構與功能特性更全面。但是通過免培養分離技術檢測出的細菌類群多數只能確定其屬水平，無法確定到種。此外，檢測到的一些不可培養的微生物在白酒釀造中的生物學特性及功能特性還需深入探討。

表2 免培養分離技術研究醬香型白酒大曲細菌多樣性的現狀Table 2 Research status of bacterial diversity of Moutai-flavor Baijiu Daqu by culture-independent technique

2 醬香型大曲細菌菌群功能特性研究方法

好曲產好酒，曲自然離不開微生物的作用。而茅臺酒采用的就是典型的細菌曲，成品高溫曲中細菌數量達90%以上，且多數為嗜熱芽孢桿菌，因而醬香型白酒主體香味主要通過這些微生物代謝產生的醬香物質或醬香前體物質形成的[37-38]。因此，深入研究醬香型大曲中細菌的產酶特性、產香特性，對解析醬香型白酒獨特風味的形成機制具有重要的指導意義。

2.1 醬香型大曲細菌產酶特性研究

醬香型大曲細菌產酶的研究主要體現在其產蛋白酶、淀粉酶、纖溶酶、糖化酶、脂肪酶和漆酶等特性。常用的研究方法主要是根據其具體的酶學特性而有所不同。比如α-淀粉酶的測定采用淀粉-碘液平板法、蛋白酶測定普遍采用酪蛋白平板法、纖溶酶活力測定采用血纖維蛋白平板法。但是此類方法只能初步確定其酶學特性，不能得知其產酶量。另一種方法是在上述方法的基礎上，采用特定酶的發酵培養基或將目標菌株直接進行固、液發酵一段時間，再運用國標測定酶的方法進行產酶特性研究，通常用酶活力單位表示。該方法能夠確定目標菌株在某一特定條件下轉化底物所需的酶量。

在醬香型白酒發酵體系中，對產酶細菌的研究主要以芽孢桿菌為主。聶慧芳等[39]從醬香型大曲中分離出兩株具有中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力的枯草芽孢桿菌，具有較高的蛋白分解能力。王曉丹等[40]研究發現，腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）、雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）能夠產酸性蛋白酶、糖化酶和脂肪酶。而關于醬香型大曲中芽孢桿菌屬釀造酶活力大小的研究現狀見表3。

表3 醬香型白酒大曲中芽孢桿菌屬釀造酶活力研究現狀Table 3 Research status of brewing enzyme activity of Bacillus in Moutai-flavor Baijiu Daqu

綜上所述，醬香型大曲細菌具有產蛋白酶、淀粉酶、纖溶酶、糖化酶、脂肪酶、漆酶等酶學特性，每種酶在醬香型白酒釀造過程中都扮演著不同的角色，且行使的作用各有差異。在白酒釀造過程中，漆酶能夠氧化愈創木酚以及在小分子介體化合物的作用下氧化酪氨酸，這些小分子介體化合物主要是醬香型白酒中的芳香族化合物，如丁香醛、丁香酸、香草醛、阿魏酸等小分子酚類衍生物[46-47]。林芬等[44]從醬香型白酒中篩選一株既產醬香又具有纖溶酶活性的細菌，通過抗凝血實驗和體外血栓溶解實驗表明，該菌株發酵上清液具有體外血栓溶解作用和抗凝血效果，該菌在白酒釀造、酶制劑、藥物、飼料、香料等產業中提供豐富的生物資源且具有很強的利用價值，其纖溶酶活性也為生產新型的溶血栓藥物提供了參考。具有中性蛋白酶活性的細菌能夠輔助霉菌中酸性蛋白酶對原料中蛋白質的降解；另外醬香型白酒固態發酵過程中耐高溫α-淀粉酶在高溫條件下能分解糧食中的淀粉，提高糧食利用率；在制作麩皮浸出汁時，加入耐高溫α-淀粉酶，采用“中溫蒸煮”法，可以降低麩皮浸出汁的糖化醪黏度，提高其流動性，有利于菌株在濃醪中發酵產香。

目前對于醬香型大曲細菌釀造酶學的研究都局限于檢測其菌株是否具有產酶特性、優化產酶條件、提升產酶能力等，而其產酶能力在整個釀造過程中對白酒風味、酒質影響機制的研究還不夠清楚。其次對于酶的提取量以及應用的研究領域也較為局限，若將其制成酶制劑運用于其他領域可為醬香型白酒中功能微生物的研究提供一個新方向。

2.2 醬香型大曲細菌產香特性研究

細菌在醬香型白酒釀造過程中主要作用是產香，近年來研究都是直接從大曲中篩選出具有產醬香風味的菌株，根據大曲獨特的環境，模擬固液發酵至一定時間再對其發酵基質進行感官與風味成分分析。常用的風味物質檢測技術有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀、氣相色譜-嗅聞（gaschromatographyolfactometry，GC-O）法等。常用的樣品前處理方法有頂空固相微萃取（head space solid-phase microextraction，HS-SPME）、液液微萃取（liquid-liquid microextraction，LLME）、攪拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）等。各檢測技術以及樣品前處理方法的基本原理、特點見表4。

表4 常用風味檢測技術及樣品前處理方法Table 4 Common detection techniques for flavor and sample pretreatment methods

近年，在對醬香型白酒大曲細菌產香功能的研究中發現，樣品前處理大多都采用頂空固相微萃取技術，因為該技術相對其他前處理技術操作簡單、快速，并能與GC-O或GC-MS聯用。隨著現代風味檢測技術的發展，解析酒的風味物質和微生物二者之間的聯系也越來越明朗，為后期研究微生物在白酒釀造過程中的作用機制提供技術支撐。

醬香型白酒在釀造過程中，微生物通過降解原料中的大分子物質，以供自身生長代謝。由于制曲溫度逐漸升高，微生物在整個制曲環境中代謝生成新的物質，使得大曲中的成分較為復雜，而新生成的物質部分具有香味，從而形成特有的白酒香味。其代謝特性研究現狀見表5。

從以上研究表明，醬香型白酒的主體香味成分仍然是研究的一大熱點，從醬香型大曲中篩選出的產醬香的細菌大多都產酸類、醇類、酯類、酮類和吡嗪類等物質。而這些物質大都呈現不同的風味，其中酯類化合物、醇類化合物、芳香族類化合物及縮醛類化合物主要貢獻較強的水果香、甜香；酸類化合物和硫化物主要貢獻腐臭味；含氮化合物、內酯類化合物主要貢獻焙烤香和杏仁香；呋喃類化合物則主要貢獻焦糖香。沈海月[54]通過比較不同貯存年份的醬香型白酒的風味，研究發現貯存時間越長的酒其醬香風味越強，主要是因為酯類、醇類化合物降低，即水果香、甜香減少有利于凸顯其醬香；同時含氮類和酚類化合物增加也有利于醬香增強。對于功能微生物純種發酵大多都只呈現一種風味，雖然檢測出的風味化合物有很多種，但是某些風味物質占比較大會掩蓋其他風味物質的風味。目前，對功能微生物的研究大多都是微生物的純種發酵感官聞香以及發酵基質成分檢測慢慢解析其產香機制。但都只找到與產醬香有關的物質，如乙偶姻、3-羥基-2-丁酮、四甲基吡嗪等。對于微生物在醬香大曲中的相互作用以及各微生物的代謝特性、酶學特性與風味物質之間的聯系對產醬香的影響都有待深入研究。

表5 醬香型白酒大曲細菌代謝特性研究Table 5 Metabolic characteristics of bacteria in Moutai-flavor Baijiu Daqu

3 功能細菌的發酵生態調控應用

如何提升酒質與出酒率以及改善酒的風味一直是企業所面臨的一大難題，而醬香型白酒釀造過程不是單一菌株作用結果，而是多種微生物相互作用，進而形成獨特的微生物區系。若僅從細菌的角度分析其功能與作用太過局限。相應地，混合發酵能從其他角度分析細菌在白酒釀造中的作用。

楊濤等[55]從醬香型大曲中篩選出5株嗜熱芽孢桿菌和3株酵母運用于白酒生產，發現用嗜熱芽孢桿菌、酵母菌與糟醅復合醬香明顯。凌杰[56]研究了醬香型白酒釀造中地衣芽孢桿菌與釀酒酵母之間的相互作用，發現釀酒酵母在發酵過程中產生的酸性環境會抑制地衣芽孢桿菌的生長，從而削減了地衣芽孢在醬香型白酒生產中的作用，但隨著制曲溫度的升高，地衣芽孢桿菌的作用越明顯，此研究只單純的分析釀酒酵母與地衣芽孢桿菌生長的關系，對釀酒酵母是如何抑制地衣芽孢桿菌的生長，其抑制機制還需深入探討。

現如今，對于從醬香型大曲中篩選出的功能微生物，大多都以混合發酵方式運用于白酒生產中，以提升白酒的風味成分，增加白酒感官品質。但是一些功能微生物所代謝產生的風味物質對于人體是有益的（如四甲基吡嗪），將其深入研究，更能體現其生物學價值。

4 總結與展望

運用傳統可培養分離技術對醬香型大曲細菌菌群結構研究發現，醬香型大曲中多數為芽孢桿菌屬，少數為微球菌屬、葡萄球菌屬、費氏鏈霉菌屬等細菌類群；采用免培養分離技術對醬香型大曲細菌菌群結構多樣性研究發現，其中主要為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、藍藻門、梭桿菌門、擬桿菌門等的細菌屬。從細菌功能性研究中表明，細菌的功能性研究太過局限，大多都局限于其代謝風味物質和酶學特性對白酒釀造過程的影響，以及微生物共培養體系相互作用對白酒風味的影響；其次，對于分離到的不可培養的微生物菌群的生理生態特性及其功能特性的研究需要深入解析。而醬香大曲中的微生物能夠保證其產生獨特的醬香風味，這主要源于其代謝的特征風味物質以及其酶學特性，如若將這些能夠代謝產風味的菌株運用于食品調味的生產以及煙葉發酵增香等領域，也為之后白酒中產香細菌提供新的研究方向。