加熱強化大曲對醬香型白酒釀造的影響研究

周榆林，吳錢弟，羅愛民

（四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都 610065）

醬香型白酒是我國主要白酒香型之一，屬大曲酒類，有醬香突出、幽雅細膩、酒體醇厚、回味悠長、空杯留香持久等典型特征[1]。曲乃酒之骨，大曲是中國白酒固態發酵的典型代表[2]，是白酒釀造生產中的糖化、發酵和生香劑，其品質對曲酒的出酒率和酒質都有極大的影響[3-4]。高溫大曲在發酵過程中，含量最高的是細菌，而細菌中最多的是芽孢桿菌[5-8]。以茅臺為代表的醬香型白酒經過長期的極端高溫訓化促成了釀酒微生態中耐高溫微生物的富集，進而賦予了茅臺酒獨特的風格和完美的品質[9]。四甲基吡嗪又名川芎嗪，天然存在于大豆食品、咖啡、乳制品中，具有一種特別的香味，在食品工業中廣泛用作調味劑、香味劑[10]。研究表明四甲基吡嗪具有擴張血管、改善微循環及抑制血小板集聚等作用，是白酒的健康因子之一，也是中國白酒的風味物質之一[11-12]，在醬香、芝麻香等采用高溫曲發酵的白酒中普遍存在[13]，說明制曲過程中的熱處理工藝與白酒中四甲基吡嗪含量存在一定關聯性。羅惠波等[14]率先開展了熱處理大曲對釀酒影響的實驗，發現熱處理大曲可豐富白酒的風味成分、提升白酒的質量，但該實驗為實驗室模擬數據，未在釀酒生產中嘗試。因此，本實驗以高溫大曲為切入點，研究將高溫工藝處理后的強化大曲應用在醬香型白酒實際生產中，探究應用熱處理大曲進行醬香型白酒發酵的規律，對于提高白酒中四甲基吡嗪含量，賦予白酒養生保健價值，提升白酒風味和品質，指導釀酒一線生產有一定參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩種大曲：常規曲是以小麥為原料，加入一定量的母曲（母曲是上一批次儲存成熟后的粉碎的大曲），采用生料制曲，經過壓制成磚形坯、攤晾、入倉發酵、翻曲、儲存等傳統工藝發酵生成的。加熱強化大曲與常規曲生產不同的是母曲在加入之前，先在65 ℃的條件下加熱5 h，然后密封冷卻后添加在小麥中制作大曲，其他生產工藝與常規曲一致。以上兩種醬香大曲由某酒廠制曲車間制得，均為存放半年后的成品曲。

糟醅：某酒廠實驗車間第四輪次發酵白酒生產中，采用6點取樣法，取不同位置的6等份糟醅樣品混合均勻為1個樣本，保留600 g，以相同的方式同步取1個平行樣，共2個樣本。每次取樣需用專用樣品袋密封，編上取樣時間及地點，取樣完成后樣品需冷藏。具體樣品名稱及相應取樣要求如下。堆積前：每個窖池取中層（第13或14甑）的糟醅，糟醅蒸完酒加曲拌勻后取樣。入池糟：堆積完成后，進行移堆破位，糟醅在下窖池時取樣，取樣需要均勻覆蓋上、中、下三層的糟醅。出池糟：分別取中層（第13或14甑）糟醅。餾酒后：每個窖池取中層（第13或14甑）的糟醅，糟醅蒸完酒加曲拌勻后取樣

酒樣：為按照生產標準掐頭去尾后的混合大宗酒樣。試劑：本實驗中所用化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 高效液相色譜儀、7890A自動進樣氣相色譜儀、Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）色譜柱：安捷倫科技有限公司；TW-200W 型可控溫電爐：成都川西行工貿有限公司；PHS-3C型電位計：杭州奧力龍儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 測定方法

糟醅理化分析：水分、還原糖、淀粉分析檢測均參考文獻[15]的方法，酸度參考杜亞飛等[16]的方法。

氨含量檢測：取大曲樣品5 g，加入50 mL質量濃度為0.2 g/mL的氯化鈉溶液，塞上蓋子，超聲振蕩10 min，濾紙過濾。然后取上清液0.8 mL于50 mL容量瓶中，蒸餾水定容，然后先加入1 mL的酒石酸鉀鈉溶液，后加入1 mL的納氏試劑，搖勻，靜置10 min后，用紫外分光光度計在波長390 nm處測吸光度值，用氯化銨標準曲線回歸方程計算樣品中氨含量。

四甲基吡嗪、乙偶姻檢測：前處理方法參考文獻[17]，均采用高效液相色譜法，采用Agilent 1260高效液相色譜儀（配安捷倫Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）色譜柱，自動進樣器、紫外檢測器）。四甲基吡嗪檢測條件為流動相比例為甲醇∶水（加0.05%三氟乙酸）=7∶3，柱溫30 ℃，檢測波長278 nm，流動相流速為1 mL/min。乙偶姻檢測條件為流動相比例為甲醇∶水（加0.05%三氟乙酸）=3∶7（V/V），柱溫30 ℃，檢測波長278 nm，流動相流速0.8 mL/min。根據樣品指標含量范圍配制相應的標準溶液進樣檢測繪制標準曲線，樣品四甲基吡嗪、乙偶姻含量可根據標準曲線的線性回歸方程求得。

酒樣風味物質檢測：參照參考文獻[18-19]，采用毛細管氣相色譜法。酒體感官質量評價由酒體中心按生產感官規范由專業人員進行感官評價，為保證感官評價公正性，所有酒樣感官評價均采用盲評方式得出。

1.3.2 生產實驗方法

將前期制成的兩種實驗用曲分別單獨粉碎，單獨存放，做到曲藥之間不交叉。實驗分為實驗組和對照組，實驗組為1個窖池，對應的大曲為加熱強化大曲組，對照組為1個窖池，所用大曲為平常生產使用的常規曲組。實驗選取窖池，要求窖池特點、結構、大小相同，環境相似。釀酒生產實驗時須做到同時開窖、同時蒸餾取酒、同時出甑、同時加曲、同時起堆、添加曲藥量相同，統一操作、統一標準，按感官標準下窖操作，盡可能保證整個實驗過程中大曲的種類不同是唯一變量，排除其他因素的影響，其余工藝控制參數根據釀酒作業指導書要求執行。

1.3.3 堆積、發酵過程溫度記錄

堆積過程中溫度的檢測：取糖化堆距離地面（90±4）cm，深度（20±3）cm，選擇3個位置插入溫度計測量溫度，同時選擇1個頂部深度（20±3）cm，記錄4個不同位置的溫度，堆積過程每隔12 h測量記錄一次溫度，最終通過取4個不同位置溫度的算術平均值為代表糟醅堆積的溫度。

發酵過程中溫度記錄：堆積過程每隔24 h測量記錄一次溫度，由于窖池較大且不同位置情況不同，故在6個固定的不同位置放置溫度計檢測發酵過程中升溫情況，取同一時刻6個點位所測得溫度的算術平均值為來反映發酵過程中該時間點窖池的溫度情況。

2 結果與分析

2.1 糖化堆積溫度變化

圖1 堆積過程中溫度的變化Fig.1 Change of temperature during the stacking process

由圖1可知，在堆積過程中溫度先有一個明顯的下降和趨于平穩的狀態，這是由于高溫大曲的主要微生物區系是細菌，前期微生物繁殖存在一個芽孢萌發和微生物生長的遲緩期，0～2 d時為微生物芽孢萌發期，細胞呼吸作用較弱，且微生物數量較少，故溫度不僅沒有上升反而存在下降的情況。2～6 d時溫度處于逐漸微微上升的過程，此時微生物處于遲緩期，這個過程中主要是新萌發的微生物適應新的環境，同時合成大量酶類，呼吸作用開始呈現逐漸增強的過程，為對數期快速增殖做準備。6～10 d時兩組實驗均出現溫度快速升高的過程，此時堆積環境中微生物處于對數期，大量代謝產能導致微生物群落趨于穩定，入池前兩組實驗入池溫度差異較小。堆積全過程溫度差異最大的階段出現在6～10 d時，對數期呈現的升溫不同也側面反映了兩者微生物群落上的差異性較大。

2.2 發酵過程中溫度變化

圖2 發酵過程中溫度的變化Fig.2 Change of temperature during the fermentation process

發酵溫度直接影響糟醅理化指標進而影響白酒品質。由圖2可知，糟醅堆積階段兩組實驗的溫度差異特點在入池發酵過程中得到更大的體現，即在發酵全過程中均呈現常規曲組溫度高于加熱強化大曲組的趨勢。整體上來看在入池發酵階段總體上兩者變化趨勢一致，均是在入池前5 d溫度上升，說明在入池前5 d內窖池內氧氣供給較充足，微生物仍然處于增殖的過程，5 d后隨著氧氣消耗，窖池內微生物開始由有氧增殖向無氧發酵產酒進行，后期也存在溫度上升的趨勢，推測這和隨著產酒過程中窖池內微生物發生改變后的群落更替有關，末期兩者溫度開始趨向一致。常規曲在發酵12 d時出現了明顯的升溫異常，相對來說加熱強化大曲組在整個發酵過程溫度變化更加穩定。堆積和發酵過程中的微生物代謝活動導致的升溫差異進一步說明了兩者在微生物群落結構上的顯著差異性，推測這種微生物群落結構的差異性是由于高溫強化大曲生產時對母曲的長時間高溫處理導致部分代謝產熱較強的微生物失活，強化大曲微生物群落中能形成芽孢的耐熱強且代謝產熱低的細菌占比更大有一定關聯性。

2.3 釀酒過程中主要理化指標對比分析

酸度、水分、淀粉、還原糖是白酒生產中重要的指標，可直接反映釀酒過程的情況和微生物群落的差異，進而影響白酒品質。

圖3 釀酒過程中酸度，水分、還原糖、淀粉含量的動態變化Fig.3 Dynamic changes of acidity,moisture,reducing sugar and starch contents during the Baijiu-making process

由圖3可知，兩組實驗酸度在堆積過程中呈現明顯降低的趨勢，這和堆積過程中處于開放的有氧的環境不利于厭氧的產酸細菌繁殖有一定關系，兩組實驗酸度在堆積過程中均處于相似水平，但隨著堆積結束入池發酵的進行，糟醅的酸度呈現顯著上升趨勢，這是由于整個發酵過程處于密封的厭氧發酵環境中，厭氧或者兼性厭氧的產酸細菌大量繁殖，導致糟醅酸度增加，且從圖3中可以明顯看出常規曲組的酸度顯著高于加熱強化大曲組實驗，這和兩種大曲中的微生物群落有著密切聯系。餾酒前后兩組實驗均呈現一定降低趨勢，說明高溫餾酒過程中有機酸揮發較多。水分含量在堆積和發酵過程中兩組均呈現出增加的趨勢，常規曲組的水分均略高于實驗組，說明在微生物群落上實驗組與常規曲組存在較大差異。還原糖與淀粉方面兩者變化均呈現較大的一致性，均呈現隨著發酵的進行不斷降低的趨勢，但本輪次堆積過程中還原糖無明顯增加，在后續輪次追蹤實驗中值得進一步觀察。值得注意的是，由于餾酒后糟醅水分降低較多的緣故，故還原糖和淀粉含量測定值呈現略微上升。從整個釀造過程可以看出實驗組與對照組在酸度、水分、還原糖、淀粉四種主要理化指標上呈現相同的變化趨勢，但兩組之間又存在一定差異，總體上反映了兩種大曲對微生物群落影響各有不同，具體機制有待進一步研究。

2.4 釀酒過程中乙偶姻、氨、四甲基吡嗪形成對比分析

圖4 釀酒過程中乙偶姻（a）、氨含量（b）及四甲基吡嗪含量（c）的變化Fig.4 Change of acetoin (a),ammonia (b) and tetramethylpyrazine (c)contents during the Baijiu-making process

兩步法形成四甲基吡嗪理論中，乙偶姻是由微生物代謝產生，乙偶姻通過與氨發生熱力學反應合成四甲基吡嗪[20]，故乙偶姻和氨的含量對于四甲基吡嗪形成至關重要。由圖4A可知，在釀酒過程中加熱強化大曲組的乙偶姻水平均高于常規曲組實驗，且在堆積過程中加熱強化組呈現上升趨勢，常規曲組乙偶姻含量無變化，說明在微生物代謝產乙偶姻方面加熱強化大曲組優勢顯著。同時可以發現微生物產生乙偶姻主要在入池發酵階段，說明乙偶姻產生與厭氧環境密切相關。由圖4B可知，氨的產生主要來自于高溫堆積階段，兩組差異不大，但常規曲組在發酵后高于加熱強化大曲組。由圖4C可知，四甲基吡嗪呈現和乙偶姻變化大致一致的趨勢，四甲基吡嗪產生也主要來自于窖池發酵階段，說明與厭氧環境有一定關聯性。兩組實驗四甲基吡嗪差異主要體現在堆積階段，可以看出加熱強化大曲組四甲基吡嗪含量有明顯的提升，但常規曲組四甲基吡嗪含量則無變化，這與乙偶姻的差異呈現一致性，說明從形成四甲基吡嗪兩步法的微生物角度加熱強化大曲優勢顯著，推測這與加熱處理后嗜熱細菌具有群落優勢有一定關聯性。但兩組實驗在出池后四甲基吡嗪則差異不大，這是由于在乙偶姻和氨方面兩者交替領先，因而在合成四甲基吡嗪上趨于一致。值得注意的是，雖然本次釀酒生產實驗一定程度上驗證了兩步法產生四甲基吡嗪的機制，加熱強化大曲也的確可以從微生物角度提升乙偶姻含量和四甲基吡嗪含量，但可以看出四甲基吡嗪含量與乙偶姻和氨含量值之間差異達3個數量級，合成反應轉化率非常低。且入池發酵后實驗組與對照組的四甲基吡嗪含量趨于一致，說明提升四甲基吡嗪含量從微生物角度入手是不夠的，還需要從提升四甲基吡嗪合成的轉化效率上開展研究。

2.5 酒樣分析對比

2.5.1 酒樣風味物質對比

兩組實驗大宗酒樣經過氣相色譜檢測，一共檢測到69種風味物質，為了方便分析，將69種風味物質經過分類計算簡化得表1。如表所示，一共在酒樣中檢測到的69種風味物質可分為7大類風味物質，其中含量從高到低依次為酯類、酸類、醇類、醛類、酮類、酚類、吡嗪類，其中酯類、酸類、醇類、醛類四類香味物質占據風味物質總含量的95%以上。并且酯類含量最高，約占總風味物質的60%左右，酯類中乳酸乙酯和乙酸乙酯占比較大，乙乳比的平衡對于醬香型白酒的風味尤其重要，賦予了醬香型白酒優雅柔的特點，總體來說常規曲組在乳酸乙酯水平上顯著高于加熱強化大曲組，而乙酸乙酯方面加熱強化大曲組高于常規曲組，故總體來說乙乳比平衡上加熱強化大曲組優于常規曲組。酸類呈現常規曲組高于加熱強化大曲組的現象，這與檢測發酵過程中的有機酸含量呈現一致，含量較高的酸是乙酸，常規曲組含量也顯著高于強化大曲組，推測這與發酵過程中加熱強化大曲組的發酵溫度顯著低于常規曲組有較大關系。醬香型白酒的標志性風味物質研究結果表明，吡嗪類可能是主要風味物質之一，兩組酒樣中吡嗪類物質均偏低，但加熱強化大曲組四甲基吡嗪含量顯著高于常規曲組，此規律與出池糟中兩者乙偶姻含量趨勢一致，推測這是由于乙偶姻和氨在餾酒過程的高溫環境下，合成了四甲基吡嗪，且合成量與乙偶姻含量正相關。

表1 酒樣風味物質對比Table 1 Comparison of flavor substances in Baijiu samples mg/100 mL

續表

2.5.2 酒樣感官評價對比

酒樣理化指標的差異在酒樣感官分析中更得到了直觀體現，具體感官評價見表2。由表2可知，總體來看加熱強化大曲組在醬香風味和酒體醇厚方面顯著優于常規曲組，四甲基吡嗪具有賦予白酒焦香氣味的功效，推測兩組實驗酒樣關于醬香風味評價上的差異正是由于兩者在四甲基吡嗪上的差異導致的。結合糟醅理化、發酵溫度，和酒樣風味三方面來看，一方面是反映了兩組實驗微生物群落結構的差異性，另外一方面正是由于在發酵中的糟醅理化和發酵溫度差異性進一步導致了加熱強化大曲組在控制酒體酸含量，平衡乙酸乙酯和乳酸乙酯比例方面更優，故反映在感官體驗上則是得到了酒體醇厚，香氣馥郁的評價。故加熱強化大曲在提升酒質方面效果顯著，總體評價為加熱強化大曲組優于常規曲組。

表2 酒樣的感官評價Table 2 Sensory evaluation of Baijiu samples

3 結論

通過加熱強化大曲組和常規曲組的理化分析對比，表明加熱強化大曲組在平衡酸度和控制發酵過程水分方面均顯著優于常規曲組。糖化堆積過程溫度兩組差異不大，但在入池發酵階段則呈現全過程常規曲溫度均高于加熱強化大曲的趨勢。乙偶姻含量在整個釀造過程中呈現加熱強化大曲優于常規曲的趨勢，說明在釀造過程中強化大曲從微生物群落角度提升四甲基吡嗪含量效果顯著，但另外一方面由于整個釀造過程中兩組實驗氨含量高低與乙偶姻含量高低呈現相反趨勢，故反映到糟醅中合成的四甲基吡嗪含量差異不明顯。大宗酒中四甲基吡嗪差異較大，常規曲組為未檢出，加熱強化大曲組四甲基吡嗪含量為0.13 mg/100 mL。但糟醅中四甲基吡嗪含量并沒有表現出明顯差異，說明提升白酒中四甲基吡嗪含量不僅僅要考慮從微生物角度出發提高乙偶姻含量，研究提高乙偶姻和氨合成四甲基吡嗪的轉化效率以及餾酒過程中四甲基吡嗪的合成和提取也是至關重要的。在白酒酒質方面則與前面的糟醅理化及溫度變化呈現一定的關聯性，加熱強化大曲組在控制酒體酸含量，平衡乙酸乙酯和乳酸乙酯比例顯著優于常規曲組。四甲基甲基吡嗪含量方面加熱強化大曲組也顯著優于常規曲組，感官上加熱強化大曲組則是得到了酒體醇厚，香氣馥郁的評價。綜合釀造過程和白酒感官理化，總體評價為加熱強化大曲組優于常規曲組，加熱強化大曲對于提升醬香型白酒品質有著良好的效果。