非釀酒酵母對有機酸類碳源代謝特征的研究

龔麗娟，孫婉瑩，鐘 武，李二虎

（華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

非釀酒酵母（non-Saccharomyces）通常存在于葡萄醪、發酵停滯或遲緩的葡萄酒，或者具有異常分析和感官特征的葡萄酒中，被認為是“野生”酵母或“腐敗”酵母[1]。盡管經常被視作果酒微生物腐敗變質的主要原因，但是目前已有較多研究表明，部分非釀酒酵母對果酒的發酵過程及品質控制具有積極作用[2]。酸度是影響果酒質量的重要因素[3-4]，其種類和含量直接或間接影響果酒的口感和品質[5]。果酒中有機酸含量在合適的范圍內時，可以有效地平衡果酒中的甜味和苦味[6]，而有機酸過量時會使酒味酸澀，造成酒體粗糙等[3-4，7]，蘋果酸和檸檬酸是影響果酒口感的兩種重要有機酸。有研究表明，利用非釀酒酵母釀造果酒，可以有效降低果酒中的有機酸含量，將其與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合發酵時可以改善果酒風味與口感[8-12]。李旋等[13-14]研究發現，粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）能減少葡萄酒中蘋果酸的含量；王立芳等[15]從葡萄園土壤中分離得到一株既能降解L-蘋果酸又能降解檸檬酸的菌株，經鑒定為陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola），對其有機酸代謝能力進行研究發現，該菌株對L-蘋果酸和檸檬酸的代謝能力受兩種酸含量的影響。不同的酵母對有機酸的利用率不同[16]，因此研究非釀酒酵母對有機酸的代謝特征以及選擇合適的酵母菌株改善果酒中有機酸含量對指導果酒釀造具有積極意義。

碳源在發酵過程中主要有兩種生理功能，一是構成細胞物質以及各種代謝產物的碳架，二是提供細胞活動所需要的能量[17]。在發酵過程中，碳源會經酵母分解代謝產生能量和一系列重要的中間代謝產物，供合成代謝所需。酵母菌的碳源來源非常廣泛，包括醇類、有機酸和氨基酸等，目前研究較多的有糖類，包括已糖、二糖以及二碳化合物[18]。在酵母對果酒中碳源代謝方面，現有研究多是集中于釀酒酵母，對非釀酒酵母碳源代謝尤其是對有機酸類碳源的代謝研究比較少見。培養基中含有不同碳源時，對有機酸的代謝會產生不同的影響[17]。

本研究以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）RV002為對照，將發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）JT-1-3和季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）JP-4-2分別接種于以L-蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖和乙醇為單一碳源或雙碳源的培養基中培養，測定酵母生物量及碳源代謝動態變化，以期探討非釀酒酵母對碳源尤其是有機酸類碳源的代謝規律，為非釀酒酵母改善果酒中有機酸含量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

葡萄酒釀酒活性干酵母RV002（釀酒酵母）：安琪酵母股份有限公司；發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）JT-1-3、季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）JP-4-2（非釀酒酵母）：由本實驗室從柑橘皮、檸檬皮、橘樹土和爛橘堆中篩選分離鑒定得到。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）培養基：北京酷來搏科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

YNB-M培養基：蘋果酸2 g/L，YNB 6.7 g/L；YNB-C培養基：10 g/L檸檬酸，YNB 6.7 g/L；YNB-G培養基：葡萄糖10 g/L，YNB 6.7 g/L；YNB-E培養基：乙醇5%，YNB 6.7 g/L。

YNB-M-G培養基：蘋果酸2 g/L，葡萄糖10 g/L，YNB 6.7 g/L；YNB-C-G培養基：檸檬酸2 g/L，葡萄糖10 g/L，YNB 6.7g/L；YNB-M-E培養基：蘋果酸2 g/L，乙醇5%，YNB6.7 g/L；YNB-C-E培養基：檸檬酸2 g/L，乙醇5%，YNB 6.7 g/L。

對第三層級的研究對象進行建模后，參考埃森曼的探討習慣和伊塔羅·格伯利尼的建筑“構成符號”分類[1]41，將對象的建筑符號分為平面符號、連接符號、圍護符號、相互交流符號和屋頂符號等5個部分進行圖解分析。且因為 “能指”與“所指”的任意性，為了更貼近集中含義3），在對應語義三角關系前已經對研究對象的設計語境（其內容包括設計師言論、地方文化、地理氣候等）進行了資料收集。

1.1.3 試劑

葡萄糖（分析純）、L-蘋果酸（分析純）、檸檬酸（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-250B生化培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；TGL-16g離心機：飛鴿儀器有限公司；UV-1700紫外可見分光光度計：日本島津公司；e2695高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）儀：美國WATERS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

取3株酵母菌（JT-1-3、JP-4-2、RV002）凍存液（50%甘油保存）各1管于YPD培養基中，于28 ℃、120 r/min條件下培養24 h后，在PDA培養基上進行劃線分離，并于28 ℃培養2 d。在PDA培養基上挑取菌落特征明顯的菌株接種于YPD培養基中，于28 ℃、120 r/min條件下培養24 h制成種子液。

1.3.2 碳源代謝特征的研究

為探究2株非釀酒酵母對單碳源（L-蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖和乙醇）的消耗利用情況以及葡萄糖或乙醇的存在對非釀酒酵母消耗利用有機酸的影響，本實驗以釀酒酵母為對照，將3株酵母菌的種子液分別接種于YNB-M、YNB-C、YNB-G、YNB-E、YNB-M-G、YNB-M-E、YNB-C-G 和YNBC-E培養基，接種量為3%（V/V），于28 ℃條件下發酵9 d，在發酵1 d、3 d、5 d、7 d、9 d時，取樣，測定生物量、L-蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖和乙醇含量。

1.3.3 檢測方法

生物量的測定：采用分光光度計在波長600 nm處測定各發酵時期發酵液的吸光度值，以OD600nm值表示酵母生物量[19]。葡萄糖含量的測定：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[20]。乙醇含量的測定：采用重鉻酸鉀氧化法[21]。有機酸（L-蘋果酸、檸檬酸）含量的測定：采用高效液相色譜（HPLC）法測定有機酸的含量[5]。

2 結果與分析

2.1 單碳源代謝特征的研究

由圖1A可知，在以L-蘋果酸為唯一碳源的YNB培養基中，3種酵母均能正常生長，對L-蘋果酸的代謝能力為酵母JT-1-3＞RV002＞JP-4-2，且酵母JT-1-3所在培養基中的L-蘋果酸含量顯著降低（P＜0.05），由1.91 g/L降至0.96 g/L。由圖1B可知，在以檸檬酸為唯一碳源的YNB培養基中，非釀酒酵母JP-4-2和JT-1-3也能夠較好地生長，而釀酒酵母RV002基本不生長；3種酵母對檸檬酸的代謝能力為酵母JP-4-2＞JT-1-3＞RV002，且酵母JP-4-2所在培養基中的檸檬酸含量顯著降低（P＜0.05），由9.86 g/L降至7.07 g/L。由圖1C可知，在以葡萄糖為唯一碳源的YNB培養基中，3種酵母均能很好地生長，3種酵母對葡萄糖的代謝能力為酵母RV002＞JP-4-2＞JT-1-3。由圖1D可知，在以乙醇為唯一碳源的YNB培養基中，3種酵母均可以生長，3種酵母對乙醇的代謝能力為酵母JT-1-3＞JP-4-2＞RV002。結果表明，酵母JT-1-3具有很強的代謝L-蘋果酸的能力，酵母JP-4-2具有很強的代謝檸檬酸的能力，而釀酒酵母RV002不能利用檸檬酸。

圖1 3種酵母在YNB-M（A）、YNB-C（B）、YNB-G（C）及YNB-E（D）培養基中的生物量及相應碳源含量的變化Fig.1 Changes of biomass and corresponding carbon source contents of three yeasts in YNB-M (A),YNB-C (B),YNB-G (C) and YNB-E (D) media

2.2 雙碳源代謝特征的研究

2.2.1 葡萄糖存在下L-蘋果酸的代謝特征

由圖2可知，在以L-蘋果酸和葡萄糖為雙碳源的培養基中，3種酵母均能夠較好地生長。其中，釀酒酵母RV002在第1天時生物量達到最大值，且消耗完培養基中的葡萄糖，L-蘋果酸含量呈現先降低后回升的現象；非釀酒酵母JT-1-3所在培養基中L-蘋果酸含量顯著降低（P＜0.05），由1.90 g/L降至1.58 g/L，且消耗葡萄糖的速度最慢，至發酵第9天時，培養基中仍有葡萄糖剩余；非釀酒酵母JP-4-2基本不消耗L-蘋果酸（P＞0.05）。結果表明，當培養基中同時含有葡萄糖和L-蘋果酸兩種碳源時，3種酵母都會優先消耗葡萄糖，非釀酒酵母JP-4-2基本不利用L-蘋果酸，非釀酒酵母JT-1-3可以利用部分L-蘋果酸，且相對于單碳源培養基，有機酸消耗量減少，這與高衛衛[16，22]的研究結果一致，即酵母會優先利用葡萄糖，且葡萄糖的存在阻礙了其他酵母對有機酸的利用。

圖2 3種酵母在YNB-M-G培養基中的生物量（A）、L-蘋果酸及葡萄糖含量（B）的變化Fig.2 Changes of biomass (A),L-malic acid and glucose content (B)of three yeasts in YNB-M-G medium

2.2.2 葡萄糖存在下檸檬酸的代謝特征

由圖3可知，在以檸檬酸和葡萄糖為雙碳源的培養基中，3種酵母均能很好地生長，且非釀酒酵母JP-4-2的生長優于非釀酒酵母JT-1-3；3種酵母所在培養基中檸檬酸的含量變化情況基本類似，均在第1天時含量顯著性下降（P＜0.05），隨后變化幅度不大（P＞0.05）；葡萄糖消耗情況為酵母RV002＞JP-4-2＞JT-1-3。結果表明，當培養基中同時含有葡萄糖和檸檬酸兩種碳源時，釀酒酵母會消耗葡萄糖，葡萄糖含量發生極顯著性變化（P＜0.01），但基本不利用檸檬酸。趙玉平等[23]對篩選出的畢赤酵母（Pichia pastoris）進行碳源代謝研究表明，其會先利用還原糖再利用檸檬酸，檸檬酸的利用會受到還原糖的阻礙，本實驗結果與其研究結果一致，非釀酒酵母JP-4-2會利用葡萄糖以及部分的檸檬酸；非釀酒酵母JT-1-3利用大部分葡萄糖以及小部分檸檬酸，且與單碳源培養相比，兩株非釀酒酵母對檸檬酸的利用率均顯著降低（P＜0.05）。

圖3 3種酵母在YNB-C-G培養基中的生物量（A）、檸檬酸及葡萄糖含量（B）的變化Fig.3 Changes of biomass (A),citric acid and glucose content (B) of three yeasts in YNB-C-G medium

2.2.3 乙醇存在下L-蘋果酸的代謝特征

由圖4可知，在以乙醇和L-蘋果酸為雙碳源的培養基中，非釀酒酵母JT-1-3的生長情況最好，JP-4-2的生長情況次之，釀酒酵母RV002的生長情況最差；釀酒酵母RV002和非釀酒酵母JP-4-2所在培養基中L-蘋果酸的含量無顯著變化（P＞0.05），而非釀酒酵母JT-1-3所在培養基中L-蘋果酸的含量顯著降低（P＜0.05），由1.97 g/L降至0.81 g/L；3種酵母所在培養基中乙醇含量除在第1天時有所減少外（P＜0.05），后續發酵過程中釀酒酵母RV002所在培養基中乙醇含量無顯著變化（P＞0.05），而非釀酒酵母JP-4-2和JT-1-3所在培養基中乙醇含量又有減少的趨勢。結果表明，當培養基中同時含有乙醇和L-蘋果酸兩種碳源時，非釀酒酵母JT-1-3既可以利用L-蘋果酸又可以利用部分乙醇，而非釀酒酵母JP-4-2與釀酒酵母RV002只能利用部分乙醇，基本不利用L-蘋果酸。

圖4 3種酵母在YNB-M-E培養基中的生物量（A）、L-蘋果酸及乙醇含量（B）的變化Fig.4 Changes of biomass (A),L-malic acid and ethanol content (B)of three yeasts in YNB-M-E medium

2.2.4 乙醇存在下檸檬酸的代謝特征

由圖5可知，在以乙醇和檸檬酸為雙碳源的培養基中，非釀酒酵母JP-4-2可以生長，非釀酒酵母JT-1-3可以微弱地生長，而釀酒酵母RV002基本不生長，且3種酵母所在培養基中檸檬酸的含量無顯著變化（P＞0.05）；非釀酒酵母JP-4-2所在培養基中乙醇含量降低幅度最大（P＜0.01），由6.35%降至5.16%，非釀酒酵母JT-1-3所在培養基中乙醇含量小幅度降低（P＜0.05），由6.50%降至5.64%，而釀酒酵母RV002所在培養基中乙醇含量無顯著變化（P＞0.05）。結果表明，當培養基中同時含有乙醇和檸檬酸兩種碳源時，3種酵母基本不消耗檸檬酸，非釀酒酵母JP-4-2可以利用部分乙醇，非釀酒酵母JT-1-3只能利用極少量乙醇，而釀酒酵母RV002基本上不利用乙醇。

圖5 3種酵母在YNB-C-G培養基中的生物量（A）、檸檬酸及乙醇含量（B）的變化Fig.5 Changes of biomass (A),citric acid and ethanol content (B) of three yeasts in YNB-C-G medium

3 結論

不同酵母對不同碳源的代謝能力有所差異，釀酒酵母RV002代謝葡萄糖的能力較強，代謝率達99.80%，基本不代謝檸檬酸；P.fermentansJT-1-3代謝L-蘋果酸的能力較強，代謝率達49.74%，代謝葡萄糖能力較弱；M.guilliermondiiJP-4-2代謝檸檬酸的能力較強，代謝率達28.30%，且代謝葡萄糖的能力優于P.fermentans。此外，培養基中的碳源成分葡萄糖和乙醇會影響酵母對有機酸類碳源代謝的能力，與以有機酸為唯一碳源的培養基相比，當培養基中同時含有葡萄糖或乙醇以及有機酸（L-蘋果酸或檸檬酸）時，除P.fermentansJT-1-3在L-蘋果酸與乙醇共存的培養基中L-蘋果酸消耗量略有增加外，其余情況下，2株非釀酒酵母對有機酸的利用率會降低。