褐藻膠裂解酶酶學性質及酶解馬尾藻工藝的響應面優化

汪梓旭，鄭志國，鮑時翔，朱 軍，鄒瀟瀟，黃惠琴*

（1.海南大學 熱帶作物學院，海南 海口 570228；2.中國熱帶農業科學院 熱帶生物技術研究所，海南 海口 571101）

我國海域遼闊，海藻資源豐富，具有經濟價值的大型海藻有100多種[1]。馬尾藻是其中常見的一類熱帶、亞熱帶大型褐藻，含有豐富的膳食纖維、褐藻膠、褐藻淀粉、礦物質、維生素等成分，其必需氨基酸含量遠高于海帶和紫菜[2-4]。但由于其細胞中含有較多褐藻膠、褐藻糖膠、纖維素等不易降解的成分，直接使用時營養成分不能得到充分吸收[5]。通過褐藻膠裂解酶進行馬尾藻酶解，可以將難以消化的褐藻膠分解成寡糖、單糖，從而提高營養價值[6-7]。通過酶法降解制備的褐藻寡糖具有多種生理活性，如促生長、增強免疫、神經保護、抗炎、抗凝、抗病毒等，在食品、藥品、農業、保健品、化妝品等領域具有廣泛的應用價值[8-12]。

褐藻膠裂解酶是多糖裂解酶的一種，可通過β-消除反應將褐藻膠降解為在非還原端具有雙鍵的不飽和寡糖[13]。由于其底物特異性，褐藻膠裂解酶可分為G嵌段特異性裂解酶（polyG lyase）、M嵌段特異性裂解酶（polyM lyase）及MG嵌段的雙功能褐藻膠裂解酶（polyMG lyase）[14]。迄今為止，已經從海洋生物（藻類、軟體動物、細菌和真菌）、陸生細菌和病毒中鑒定出褐藻膠裂解酶[15]，其中海洋細菌是褐藻膠裂解酶的重要來源，如假單胞菌[16]、黃桿菌[17]、交替假單胞菌[18]、弧菌[19]、芽胞桿菌[20]等。本論文以實驗室自行制備的褐藻膠裂解酶為研究對象，對其酶學性質和酶解馬尾藻的工藝進行研究，為褐藻寡糖的規模化生產與應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

褐藻膠裂解酶粗酶液：本實驗室制備保存。

孤囊馬尾藻（Sargassum oligocystum）：產自海南瓊海海域。用自來水洗去鹽分等雜質，曬干、粉碎，過60目篩，得到馬尾藻粉末。

海藻酸鈉（食品級）、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：索萊寶生物科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

褐藻膠裂解酶活性檢測培養基：褐藻酸鈉5.0 g/L，（NH4）2SO45.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH7.5。

1.2 儀器與設備

SP-756PC紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；MK2000-2E干式恒溫器：杭州奧盛儀器有限公司；ZHWY-2112B恒溫振蕩培養箱：上海智城分析儀器制備有限公司；5804R冷凍離心機：德國艾本德股份公司；R215旋轉蒸發器：瑞士布琪有限公司；DZF-6051真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 褐藻膠裂解酶酶活活性測定

取褐藻膠裂解酶粗酶液10 μL點樣于活性檢測培養基上，以加入滅活酶液為空白對照，室溫條件下反應16 h后，加入10 mL 1 mol/L CaCl2溶液，5～10 min后觀察，產生透明圈則表明此裂解酶對聚古羅糖醛酸（polygulouronic acid，PG）的特異性；產生暈圈則表明對聚甘露糖醛酸（polymannuronic acid，PM）的特異性[21]。

酶活定量測定采用紫外吸收法[22]：取1.8 mL底物（3.0 g褐藻酸鈉溶于1 L 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）），40 ℃預熱5 min，加入0.2 mL待測樣品，40 ℃溫浴10 min，100 ℃加熱10 min滅活混合反應體系，以加入滅活酶液的混合體系為空白對照，測定在波長235 nm處的紫外吸收值。在上述酶活測定方法下，定義波長235 nm處的紫外吸收值每分鐘增加0.1的酶量為酶的一個活力單位（U/mL）。

1.3.2 酶學性質試驗

酶液制備：采用硫酸銨沉淀法[23]。將粗酶液在4 ℃條件下加入飽和度為80%的硫酸銨，靜置過夜，將溶液10 000 r/min離心30min（4℃），保留沉淀，加入少量磷酸緩沖液（0.05mol/L，pH 7.0）溶解，裝入透析袋，在相同緩沖液中進行透析處理，每隔6 h更換緩沖液，透析24 h。以透析后酶液作為酶學性質測定酶液。

溫度穩定性和最適反應溫度試驗[24]：粗酶液在不同溫度（4 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）條件下溫育1 h后，測定酶的熱穩定性，將最高酶活定義為100%。測定在上述不同溫度條件下的酶活，以確定其最適反應溫度。

pH穩定性和最適反應pH試驗[25]：分別以Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 3～8）、Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6～8）、Tris-HCl緩沖液（pH 7～9）作為底物緩沖液，以置于4 ℃保留24 h后的殘留酶活力來表征pH穩定性。在上述緩沖液中測定酶活，確定該酶最佳反應pH值，將最高酶活定義為100%。

不同金屬離子及化合物質對酶活性的影響[25]：在底物中分別加入終濃度為1 mmol/L的KCl、CaCl2、NH4Cl、FeSO4、MgCl2、ZnSO4、BaCl2、MnSO4、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、尿素，研究其對酶活力的影響。定義空白組（未添加金屬離子及化合物質）的相對酶活力為100%。

1.3.3 寡糖提取與含量測定

向酶解馬尾藻粉中加入適量無菌水，混勻，抽濾得寡糖溶液。濾渣用等量無菌水重復提取3遍，合并濾液。按照1∶100（V/V）加入30%H2O2，95 ℃加熱5 min使其脫色，放入真空干燥箱濃縮至原來的1/10，加入3倍體積的無水乙醇，混勻、靜置過夜后離心，取上清液，干燥后得到粗寡糖。

寡糖含量測定：采用DNS法[26]測定。以葡萄糖醛酸作為基準物質，分別以葡萄糖醛酸質量濃度、OD540nm值為橫、縱坐標得到葡萄糖醛酸吸光度值-質量濃度標準曲線回歸方程為Y=2.401 1X+0.020 4，相關性系數R2達0.999 4。將粗寡糖溶于1 mL蒸餾水中，加入3.0 mL DNS試劑，沸水浴15 min，冷卻后定容至25 mL，測定OD540nm，根據回歸方程計算出寡糖含量。

1.3.4 馬尾藻酶解工藝優化

單因素試驗：以寡糖含量為響應指標，酶解的工藝基本參數固定為含水率67%、酶解時間10 h、酶解溫度30 ℃。在基本參數下采用單因素法依次考察含水率（67%、75%、80%、83%）、酶解時間（0、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h）、酶解溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）對寡糖含量的影響。寡糖提取與測定方法參考1.3.3進行。

響應面優化：根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，選取3因素3水平試驗對酶解條件進行優化，試驗因素和水平見表1，每組試驗重復3次，取平均值。利用Design-Expert 8.0.6 軟件優化工藝條件。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests

2 結果與分析

2.1 褐藻膠裂解酶活性測定

由圖1可知，褐藻膠裂解酶粗酶液在檢測培養基上，觀察到重復試驗1、2兩處均有兩種類型的膠凝反應，說明具有PM和PG底物特異性，空白對照未發生膠凝反應。測定其粗酶液酶活為15.20 U/mL。

圖1 褐藻膠裂解酶檢測平板上的透明圈Fig.1 Transparent zone on alginate lyase activity assay plate

2.2 褐藻膠裂解酶酶學性質

2.2.1 溫度穩定性和最適反應溫度

由圖2可知，酶液在低于40 ℃的條件保溫1 h，酶活力可保持90%以上；當溫度高于40 ℃，酶活力急劇下降，在60 ℃保溫1 h后僅剩24%酶活力，當溫度達到70 ℃時活性近乎喪失，說明該酶不宜在高溫環境中貯存。由圖3可知，酶在不同溫度下表現出來的酶活力差異很大，最適酶促反應溫度為50 ℃，當低于40 ℃或高于60 ℃時酶活性急劇降低。

圖2 褐藻膠裂解酶的溫度穩定性Fig.2 Temperature stability of alginate lyase

圖3 溫度對褐藻膠裂解酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on alginate lyase activity

2.2.2 pH穩定性和最適反應pH

由圖4可知，pH為6～8時剩余酶活力均達到90%以上，pH7時剩余酶活力最高，pH3時酶活力仍達到60%。由圖5可知，在pH 8時反應酶活性最高，在pH 7～9區間內酶反應活性在70%以上，由此可見該酶在pH接近中性時穩定性較好。

圖4 褐藻膠裂解酶的pH值穩定性Fig.4 pH value stability of alginate lyase

圖5 pH值對褐藻膠裂解酶活力的影響Fig.5 Effect of pH value on alginate lyase activity

2.2.3 金屬離子及化學物質對酶的影響

由圖6可知，Ca2+、Mg2+和Fe2+對酶活性顯示出促進作用，Ca2+可提高酶活16.5%，其次為Mg2+、NH2+和Fe2+等，而Ba2+、Zn2+和Mn2+等金屬離子對酶活性顯示出抑制作用。EDTA對該酶活性影響最大，剩余酶活性僅約為對照組的27.1%。

圖6 不同金屬離子及化學物質對褐藻膠裂解酶活性的影響Fig.6 Effect of different metal ions and chemical components on alginate lyase activity

2.3 馬尾藻酶解工藝優化

2.3.1 單因素試驗

圖7 含水率對褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻的影響Fig.7 Effect of water content on enzymatic hydrolysis of Sargassum by alginate lyase

由圖7可知，含水率為67%～75%時，隨著含水率的提高，寡糖含量逐漸升高，當含水率達到75%時寡糖含量為38.29 mg/g，含水率高于75%時寡糖含量無顯著提高。考慮到實際生產體系中增高含水率會增加后期的生產成本，選擇馬尾藻適宜的含水率為75%。

圖8 酶解時間對褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻的影響Fig.8 Effect of enzymolysis time on enzymatic hydrolysis of Sargassum alginate lyase

由圖8可知，反應初期隨酶解時間的延長，寡糖含量快速上升，在8 h時寡糖的增加趨于平緩，到10 h時達到最大值39.90 mg/g。因此，選擇酶解時間為10 h。

圖9 酶解溫度對褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻的影響Fig.9 Effect of enzymolysis temperature on enzymatic hydrolysis of Sargassum by alginate lyase

由圖9可知，隨酶解溫度的升高，寡糖含量先快速上升，40 ℃后緩慢下降。這是因為酶促反應溫度為40～60 ℃時酶活力最好，一定范圍內提高溫度酶活增加，寡糖含量隨之提高，但升高至40 ℃后，酶的熱穩定性急劇降低，導致酶活減小，寡糖的含量降低。因此，選擇最適酶解溫度為40 ℃，此時寡糖含量為40.47 mg/g。

2.3.3 響應面試驗設計結果與分析

以含水率、酶解時間和酶解溫度為主要影響因素，以褐藻寡糖含量（Y）為響應值，確定褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻藻粉的最佳酶解工藝條件，試驗方案及寡糖含量如表2所示。

根據表2的結果，用Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析，結果見表3。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續表

由表2、表3可知，試驗所選模型極顯著（P＜0.01）。一次項中酶解溫度（A）和含水率（C）對寡糖含量影響均達極顯著水平（P＜0.01），二次項中A2、B2和C2對寡糖含量影響極顯著（P＜0.01），交互項中AC影響顯著（P＜0.05）；B（酶解時間）影響顯著（P＜0.05），而AB、BC影響不顯著。各因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，影響程度為：含水率＞酶解溫度＞酶解時間。采用Design-Expert 8.0.6軟件對表3的數據進行回歸分析，得三元二次回歸方程：Y=1.86A+1.11B+7.15C+0.056AB-1.38AC-0.23BC-4.87A2-3.30B2-9.161C2+49.09。

用Design-Expert 8.0.6軟件分析模型的可信度，模型的決定系數R2=0.993 8，調整決定系數R2Adj=0.985 9。R2接近1，表明模型預測的響應值準確，可用于試驗分析和預測。變異系數（coefficient of variation，CV）反映試驗的可重復性，其值越小表明試驗越精確，模型變異系數（CV）=2.09%＜10%；模型信噪比Adeq Precision=34.369＞4，表明模型的相應信號足夠強，模型可信并可用于擬合試驗結果。綜上分析，該模型可用于分析預測褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻的工藝。

響應面法的分析圖是特定的響應值與自變量的三維空間圖，能直觀反映自變量對響應值的影響程度。酶解時間含水率與酶解溫度的交互作用對寡糖含量的影響，響應面發生了彎曲，表明其對寡糖含量的影響不是簡單的線性關系。由圖10可知，酶解時間對寡糖含量的影響大于酶解溫度的影響，兩個因素的交互作用不顯著。同樣，圖10（b）和圖10（c）響應面也發生了彎曲，表明含水率和酶解溫度與寡糖含量也不是簡單的線性關系，進一步優化得含水率對寡糖含量的影響大于酶解溫度和時間的影響。從圖10（a）可以看出含水率與酶解溫度的交互作用顯著，圖10（c）可以看出含水率與酶解時間的交互作用不顯著，以上結果與表4回歸方程方差分析結果一致。

基于軟件分析得出的最佳酶解條件為含水率75.64%、酶解時間10.31 h、酶解溫度40.69 ℃，該條件下寡糖含量理論值為50.66 mg/g。實際操作中，調整含水率為75%、酶解時間為10.3 h、酶解溫度為40.7 ℃，得寡糖含量實際值為50.42 mg/g，與預測值接近，表明回歸模型與試驗結果符合良好，回歸方程能真實地反映含水率、酶解溫度、酶解時間對寡糖含量的影響，模型具有可行性。

圖10 酶解時間、溫度與含水率交互作用對寡糖含量影響的響應曲面和等高線Fig.10 Response surface plots and contour line of effects of interaction between hydrolysis time,temperature and water content on polysaccharide yield

3 結論

通過研究酶學性質，發現實驗室制備的褐藻膠裂解酶反應最適溫度為50 ℃，最適pH值為7.0，在pH 5.0～9.0及低于40 ℃的環境中比較穩定。Ca2+、Mg2+和Fe2+等離子對褐藻膠裂解酶有促進作用，EDTA、Ba2+、Zn2+等有抑制作用。通過單因素和響應面法試驗，獲得了褐藻膠裂解酶酶解馬尾藻的最佳酶解工藝條件為含水率為75%、酶解時間為10.3 h、酶解溫度為40.7 ℃。此優化條件下寡糖含量為（50.420.24）mg/g。本試驗可為菌株HB172198產褐藻膠裂解酶的工業應用和馬尾藻的固體酶解工藝提供理論依據和技術參考。