不同品種藍莓花色苷及其抗氧化活性分析

劉笑宏，李公存，沙玉芬，王建萍，顧 亮，趙玲玲，蘇佳明

（山東省煙臺市農業科學研究院，山東 煙臺 265500）

藍莓是一種營養價值較高的水果，既可鮮食又可深加工成果汁、果酒、果醬。藍莓中含有豐富的花色苷，是由花色素和糖苷結合而成[1]，可賦予植物的花朵、果實等器官以不同的顏色[2]，它還是一種極其有效的天然水溶性自由基清除劑，具有清除自由基、延緩衰老、抗氧化等多種生理功能[3-5]，其淬滅自由基的能力，是維生素C（vitamin C，VC）的20倍、維生素E（vitamin E，VE）的50倍[6]，柳嘉等[7]研究40種富含花色苷的蔬菜和水果表明，藍莓的花色苷含量最高，被評為“人類五大健康食品之一”[8]、列入世界第3代水果行列[9]。近年來，由于植物花色苷色澤鮮亮、水溶性高，安全性強，有取代人工色素的趨向[10]，因此藍莓花色苷的提取與利用也受到食品加工業的廣泛關注。

膠東半島是我國藍莓的主要采摘區之一[11]，藍莓品種以高叢藍莓為主，高叢藍莓花色苷種類少、含量低[12]，但藍莓的高含量花色苷是其重要果實品質，因此，選育人工栽培模式下，色素含量豐富、品質優良的高叢藍莓品種具有較大的市場潛力。據調查，膠東地區的藍莓主栽品種藍豐的連續豐產能力強，但果實風味平淡、糖酸比偏低，受歡迎程度已逐年下降；萊格西也是膠東地區栽培面積較廣的品種之一，土壤適應性強、栽培管理容易、耐儲運，在膠東半島栽培面積較大；綠寶石和珠寶均是20世紀90年代由佛羅里達選育的新品種，產量較高、風味較好，已成為加利福尼亞州、佛羅里達州及多數東南地區主導的高叢品種[13]，近幾年，二者在膠東地區的栽培面積迅速擴大，發展迅猛，果實風味濃厚、果皮顏色較深，深受歡迎，但未見到二者花色苷單體種類及含量的相關研究報道，因此，本實驗采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜（ultra performanceliquid chromatography-quadrupole-time of flight-tandemmass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS/MS）聯用技術，測定了膠東地區4個主栽藍莓品種的花色苷單體種類及含量，并對其抗氧化活性高低進行了比較，以期為膠東半島功能性品種的推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍豐、萊格西、珠寶、綠寶石：均采自山東省煙臺市農業科學研究院海陽藍莓種植基地。

2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、福林酚試劑、1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：美國Sigma公司；花青素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，Cy）（純度≥98%）：蘇州科銘生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GL-20G-Ⅱ離心機：中國安科公司；ZMD 4000高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）儀：美國Waters公司；PB-10 pH計：德國Sartorius公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 實驗樣品來源及預處理

實驗于山東省煙臺市農業科學研究院海陽藍莓種植基地進行。實驗地屬溫帶濕潤性季風氣候，年平均降水量524.9 mm，年平均氣溫13.4 ℃，年平均日照時數2 488.9 h。供試藍莓品種為藍豐、萊克西、珠寶和綠寶石。實驗所用藍莓苗木均定植于2013年，南北行向種植，株距0.8 m，行距2 m，栽培管理措施一致。每個品種選擇長勢一致的植株，10株為一小區，重復3次，計30株。果實達到商品成熟時，每株藍莓采集10粒果實。部分漿果液氮冷凍后貯藏于-20 ℃供次生代謝產物測定，其余漿果剝皮，果皮單獨成包，每個品種5包，液氮冷凍后貯藏于-80 ℃，供花色苷單體測定。

1.3.2 次生代謝產物的測定

Folin-Ciocalteu法[12]測定果實總酚含量、亞硝酸鹽-氯化鋁法[14]測定果實類黃酮含量、pH示差法[15]測定果實花色苷含量。

1.3.3 花色苷類物質的提取與測定

2017年，山東省各級財政評審機構立足業務職能，不斷深化認識，圍繞黨委政府工作重點，積極開展項目評審，“管家、理財、參謀”作用得到充分發揮。經統計，全省共完成評審項目30264個，評審額3084.06億元，審減資金304.4億元，審減率9.73%。通過項目評審，有效節約了財政資金，提高了預算管理的科學化、精細化、規范化水平。

藍莓果實花色苷的提取參照劉蕓等[12]的實驗方法，略有改動。準確稱取藍莓果皮0.500 0 g，加入5 mL含5%甲酸的甲醇溶液，超聲提取15 min，于10 ℃、12 000 r/min的條件下離心20 min，收集上清液，繼續用5 mL含5%甲酸的甲醇溶液超聲提取殘渣20 min，于10 ℃、12 000 r/min的條件下離心20 min，合并2次提取的上清液，定容至10 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾后進行液相檢測。

花色苷的測定采用UPLC-Q-TOF-MS/MS，定性工作基于已有文獻中的紫外光譜圖、質譜圖和保留時間等信息的比對分析[14，16]。質譜結果用Mass Lynx V4.1（Waters）分析軟件進行分析，物質結構的鑒定參考標準物質及郭曉倩等[17]的方法。

標準物質為花青素-3-O-葡萄糖苷（y），其他花色苷以相當于Cy含量計。將花色苷按構成花色素基本單元分為四類：花翠素類、花青素類、甲基花翠素類、二甲花翠素類。

1.3.4 體外抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除率、鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）還原力的測定參考陳純[18]的方法、ABTS清除率參考楊延峰等[19]的方法。

1.3.5 數據處理

數據整理及作圖均采用Excel 2010，方差分析采用DPS 7.05。

2 結果與分析

2.1 不同品種藍莓酚類物質含量分析

不同品種藍莓酚類物質含量分析見圖1。由圖1可知，綠寶石的總酚和花色苷在所有品種中最高，總酚含量達13.11 mg/g，比藍豐顯著提高29.10%（P＜0.05），花色苷含量達2.26 mg/g，是藍豐花色苷含量的2.66倍；珠寶的花色苷含量比藍豐顯著提高86.47%（P＜0.05），總酚和類黃酮與藍豐無顯著差異（P＞0.05）；萊格西的類黃酮含量達藍豐的2.41倍，但與綠寶石的類黃酮含量無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 不同品種藍莓酚類物質含量分析Fig.1 Analysis of phenolic compounds contents in different blueberry varieties

2.2 不同品種藍莓花色苷單體特性分析

不同品種藍莓花色苷單體種類及含量分析見表1。由表1可知，4種藍莓的花色苷整體結構以單糖二聚體為主，糖苷為半乳糖糖苷、葡萄糖糖苷和阿拉伯糖苷，以葡萄糖苷種類最多。

表1 不同品種藍莓花色苷單體分析Table 1 Analysis of anthocyanin monomers in different blueberry varieties

從花色苷單體含量來看，藍豐含量最高的是二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷，但含量僅為1 717.64 mg/kg，二甲花翠素-3-O-半乳糖苷含量次之，而萊格西、綠寶石和珠寶中則是以二甲花翠素-3-O-半乳糖苷含量最高，含量分別達3 536.26 mg/kg、3 737.84 mg/kg、3 481.35 mg/kg，萊格西和綠寶石含量次高的花色苷單體為花翠素-3-O-半乳糖苷，而珠寶含量次高的花色苷單體為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，此外，珠寶的花翠素-3-O-半乳糖苷和花翠素-3-O-阿拉伯糖苷含量也達2 000 mg/kg，其花色苷單體含量在2 000 mg/kg以上的花色苷種類最多，占總數的30.11%，萊格西和綠寶石均占18.18%，藍豐為0。不同種類花色苷比較可知，花青素類花色苷單體種類少、含量低，僅檢測到2種，且含量均≤100 mg/kg，花青素-3-O-阿拉伯糖苷含量以萊格西最高，而花青素-3-O-葡萄糖苷則以珠寶含量最高。

將所有檢測品種進行花色苷總量比較可得，僅藍豐花色苷總含量不足6 000 mg/kg，萊格西和綠寶石含量在10 000～20 000mg/kg，珠寶含量最高，為20 237.68 mg/kg，是藍豐花色苷總量的3.43倍，比萊格西含量顯著提高81.01%（P＜0.05），與綠寶石無顯著差異（P＞0.05）。

由此可見，不同品種藍莓糖苷鍵無差異，但主要花色苷單體不同；珠寶花色苷單體種類更豐富、花色苷總含量更高，綠寶石次之。

2.3 不同品種藍莓花色苷相對含量分析

不同品種藍莓花色苷相對含量分析結果見圖2。由圖2可知，藍豐以二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷單體占比最高，其余三者則均以二甲花翠素-3-O-半乳糖苷單體占比最高，藍豐有二甲花翠素-3-O-半乳糖苷、二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷3種單體含量占比達10%以上，而萊格西花色苷單體占比大部分在10%～20%，綠寶石和珠寶則大多在10%左右。

從單體組分相對含量相似度來看，藍豐的二甲花翠素-3-O-半乳糖苷和二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷占比在25%以上，花翠素-3-O-阿拉伯糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷占比在10%左右，花翠素-3-O-半乳糖苷、甲基花翠素-3-O-阿拉伯糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-半乳糖苷以及甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷含量占比均在5%左右；萊格西的二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷和花翠素-3-O-半乳糖苷占比在15%以上，花翠素-3-O-阿拉伯糖苷和甲基花翠素-3-O-半乳糖苷占比在10%左右；綠寶石花色苷單體占比次高的為花翠素-3-O-半乳糖苷，占18.06%，花翠素-3-O-阿拉伯糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷和甲基花翠素-3-O-半乳糖苷占比均在10%左右，花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷和甲基花翠素-3-O-阿拉伯糖苷占比均在5%左右；珠寶的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷占比僅比二甲花翠素-3-O-半乳糖苷少0.03%，花翠素-3-O-半乳糖苷占比接近15%，花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-阿拉伯糖苷、二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷、甲基花翠素-3-O-半乳糖苷和甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷的占比均在10%左右。

圖2 不同品種藍莓花色苷單體相對含量分析Fig.2 Analysis of relative content of anthocyanin monomers in different blueberry varieties

由此可見，綠寶石和珠寶各種花色苷單體含量比例相對均衡；組分組成相似，均與藍豐有較大差異。

圖3 不同品種藍莓花色苷組成相對含量分析Fig.3 Analysis of relative contents of anthocyanin composition in different blueberry varieties

花色苷單體按花色素基本單元分類結果見圖3。由圖3可知，各品種均以二甲花翠素類花色苷為主，占比達41%～68%，花翠素類花色苷占比次之，比例為17%～34%，花青素類花色苷占比最低，均為1%；藍豐花色苷基本單元組成與萊格西、珠寶、綠寶石相差較大，珠寶和綠寶石花色苷組成極為相似。聯合花色苷含量分析得，珠寶的花青素類、甲基花翠素類、花翠素類花色苷含量分別達藍豐的4.47倍、5.14倍、7.10倍，為萊格西的1.76倍、2.15倍、2.00倍，分別比綠寶石顯著提高14.61%、27.81%、49.89%（P＜0.05），同時，珠寶的二甲花翠素類花色苷分別比藍豐、萊格西顯著提高93.30%、41.54%（P＜0.05），但與綠寶石未形成顯著性差異（P＞0.05）。

由此可見，二甲花翠素類花色苷是藍莓的主要花色苷，花翠素類、甲基花翠素類花色苷占比次之，花青素類花色苷占比最低；萊格西、珠寶和綠寶石花色苷組分相似，珠寶和綠寶石相似度極高，可能存在一定的親本關系。

2.4 不同品種藍莓花色苷抗氧化活性分析

不同品種藍莓花色苷抗氧化活性分析結果見圖4。由圖4可知，所測品種的ABTS自由基清除率均在0.98以上，無顯著差異（P＜0.05）；DPPH自由基的清除率以珠寶最高，達72.02%，比藍豐顯著提高58.25%（P＜0.05），但與綠寶石和萊格西未形成顯著差異（P＞0.05）；就總還原力來看，珠寶、綠寶石和萊格西的FRAP值均高于2.0 mmol/L，分別比藍豐顯著提高62.29%、55.95%和43.29%（P＜0.05），即珠寶、綠寶石和萊格西的總還原力均顯著高于藍豐（P＜0.05）。

圖4 不同品種藍莓花色苷抗氧化活性分析Fig.4 Antioxidant activity of anthocyanins of different blueberry varieties

3 討論

品種是決定果實的營養物質組成和含量的重要因素。次生代謝產物的生物合成由結構基因和調節基因共同調控[20-21]。本實驗中4個品種藍莓的總酚、類黃酮和花色苷差異顯著，可能是由于品種影響調控基因的表達，從而影響了花色苷的種類和含量[22]；實驗所檢測到的花色苷單體種類、糖苷鍵種類與張美嬌等[23-24]研究結果一致，但均未檢測出甲基花青素類花色苷，且藍莓的主要花色苷單體并非花青素-3-O-半乳糖苷，與前人研究結果不同[25-26]，這可能與藍莓的生長環境、地域條件有關[27-28]。

酚類物質是決定植物抗氧化活性的重要物質。前人研究表明[29-30]，植物多酚類和黃酮類物質具有較強的抗氧化活性，在多酚氧化酶的作用下可高效生成萘醌類化合物，并產生自由基。本實驗研究顯示，珠寶和綠寶石的總酚含量較高、類黃酮類物質含量偏低，但二者的DPPH自由基清除率和總還原力均較強，這可能與花色苷的結構、組成與含量有關[31-32]，實驗中，珠寶和綠寶石的花色苷含量、甲基化程度均較高，且珠寶檢測到乙酰化花色苷，這均可在一定程度上提高珠寶和綠寶石果實的抗氧化性。

4 結論

珠寶和綠寶石的總酚、類黃酮和花色苷含量均較高，且二者的花色苷種類豐富、抗氧化活性強。藍豐、萊格西、珠寶和綠寶石花色苷單體均以葡萄糖苷二聚體、二甲花翠素類花色苷為主；不同藍莓品種主要花色苷組分不同，藍豐以二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷為主，萊格西、綠寶石和珠寶以二甲花翠素-3-O-半乳糖苷為主；珠寶和綠寶石花色苷單體組成極為相似，可能存在一定的親本關系；對于膠東地區而言，可考慮將珠寶、綠寶石作為功能性主推藍莓品種。