黑加侖果酒發酵動力學研究

張 琪，朱立斌，朱 丹，苗欣月，牛廣財 *，魏文毅

（1.黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319）

黑加侖（Ribes nigrumL.）學名黑穗醋栗，俗稱黑豆果或紫梅[1]，屬虎耳草科茶藨子屬，多年生小型灌木植物[2]。果實為球狀黑色，味道酸甜可口，主要分布在新疆阿勒泰、伊犁河谷、黑龍江及遼寧等地區[3]。黑加侖果實含有豐富的營養物質，如有機酸、維生素、黃酮類物質、礦物質、生物類黃酮、花青素、酚類物質[4-5]、多糖等生物活性物質。其中維生素C含量特別高；鮮果中花青素含量可達到90 mg/100 g，花色苷含量可達172 mg/100 g[2]。因此，黑加侖可預防心腦血管疾病，改善視力，具有提高免疫力、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血壓等功效[6-12]。所以，黑加侖有很大的市場價值和開發潛力，黑加侖產品以果汁和果酒為主。

以新鮮黑加侖果為原料，經過酵母菌發酵而成的低度果酒很受消費者歡迎。黑加侖果酒在發酵過程中，還原糖含量的下降、酵母菌數目的生長以及酒精度的變化都有一定的規律。發酵動力學是對微生物生長和產物形成過程的定量描述，研究發酵過程中菌體的生長、底物消耗和產物合成之間的動態平衡及內在規律。果酒發酵動力學主要研究菌體數目的變化、糖的消耗以及酒精度的生成情況。目前，關于發酵動力學的研究較多，如李敏杰等[13]對蓮霧果酒發酵過程中酵母菌的數量、酒精度、總糖含量隨時間的變化情況進行非線性擬合，其擬合度R2分別為0.949、0.979、0.997，能較好反映蓮霧果酒發酵過程中各項指標的變化情況；張琪等[14]對沙棘果酒發酵過程中酵母菌的數量、酒精度、總糖含量隨時間的變化情況進行非線性擬合，擬合度均＞0.95，為沙棘果酒發酵提供理論基礎。李雪等[15]使用Logistic模型、SGompertz模型和Dose Resp模型進行了非線性擬合，3種模型的預測值和測量值的擬合值均＞0.99。靳夢楚等[16]采用Logistic和DoseResp模型對紅心火龍果果酒不同發酵時期的酵母菌數目、酒精度、殘糖量進行非線性擬合，擬合度均＞0.99，能較好地描述發酵中的動力學特征。這些模型均具有良好的擬合效果，可以很好的反映出果酒發酵過程中酵母菌數量，酒精含量和糖的含量的動態變化，有利于工業化生產。

本試驗擬采用經典的Logistic模型、SGompertz模型和Dose Resp模型和Boltzmann模型，對黑加侖果酒發酵過程中酵母數量的變化、酒精生成和還原糖消耗情況進行非線性擬合，建立發酵動力學模型，通過對黑加侖果酒發酵動力學的研究，可以為控制黑加侖果酒的發酵生產提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑加侖果（可溶性固形物含量12%）：購于黑龍江省農科院漿果研究所；RV171型葡萄酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖（食品級）：黑龍江北方糖業股份有限公司；Pectinex XXL果膠酶（酶活10 000 U/mL）：諾維信（中國）生物技術有限公司；3,5-二硝基水楊酸、福林酚（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；偏重亞硫酸鈉（分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

WS108手持式折光儀：河北潤聯科技開發有限公司；HR7633打漿機：飛利浦家庭電器（珠海）有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海森信實驗儀器有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計：上海凌析儀器有限公司；L420臺式低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DRP-9082型電熱恒溫培養箱；YS100尼康生物顯微鏡：日本尼康公司；EX324電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑加侖果酒發酵工藝流程與操作要點

黑加侖果→挑選→打漿→酶解→調整糖度→殺菌→接種→恒溫發酵→黑加侖果酒

操作要點：

取一定量的黑加侖果，用打漿機打漿，測其可溶性固形物的含量[17]。用果膠酶進行酶解，酶解溫度為45～50 ℃，酶解時間3 h[18]。加入白砂糖調整果漿糖度至21°Bx，加入40 mg/kg的SO2，并冷卻至室溫。取一定量的干酵母，溶于其10倍體積的黑加侖汁和蒸餾水（兩者體積比為1∶2）中，在35 ℃條件下將酵母菌活化30 min。接種前在60 ℃條件下殺菌30 min，然后冷卻至室溫，接入5%活化好的酵母菌，于21 ℃條件下恒溫發酵一定時間，得到黑加侖果酒。

1.3.2 發酵動力學主要指標的測定方法

（1）酵母菌數量：將發酵液取出用蒸餾水稀釋一定倍數，滴于血球計數板上，在光學顯微鏡下直接計數。

（2）還原糖含量測定：采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖的質量濃度[19]。葡萄糖標準曲線回歸方程：y=0.538 9x-0.016 1，相關系數R2=0.997 2。

（3）酒精度測定：采用先蒸餾，然后用密度瓶法測定黑加侖果酒的酒精度[20]。

（4）可溶性固形物測定：取少量液體樣品，置于手持式折光儀上，進行讀數。

1.3.3 動力學模型建立方法

酵母菌生長動力學模型擬合：采用典型的“S”曲線模型：通過非線性擬合Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型，并對三種模型擬合程度進行比較。相關系數（R2）越大，擬合度越高，最后選擇相關系數最大的模型來描述[15]。

酒精生成動力學模型擬合：在酵母菌生長的過程中會利用還原糖產生酒精，所以酒精的生成與酵母的生長有著直接的關系，屬于生長“耦聯”型。所以選擇“S”型曲線：Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型進行擬合，選取相關系數最大的模型描述酒精度的變化。

還原糖含量動力學模型擬合：在黑加侖果酒的發酵過程中，還原糖主要用于生產酒精。選用經典模型中的Logistic模型、Botlzman模型與DoseResp模型進行非線性擬合，擬合后選取相關系數最大的模型描述還原糖含量的變化。

2 結果與分析

2.1 黑加侖果酒發酵過程中酵母菌數量、酒精度以及還原糖含量的變化

圖1 黑加侖果酒發酵過程中酒精度、酵母菌數、還原糖含量變化Fig.1 Changes of alcohol content,yeast count and reducing sugar content during the fermentation of blackcurrant fruit wine

由圖1可知，發酵初期，24 h之前酵母菌生長較緩慢，該過程酵母菌代謝系統適應發酵環境，表現為菌體數量增加較慢；果酒發酵24 h后，酵母菌進入指數生長期，在短暫適應期后，糖分被菌體快速消耗，菌體數量以幾何級數增長；發酵到達144 h后，由于體系基質消耗殆盡，代謝產生的酒精積累在一定程度上也抑制菌體生長[21]，菌體生長進入穩定期，酵母菌數量最高達1.035×108CFU/mL。酵母菌利用還原糖代謝產生酒精，發酵過程中，前24 h酒精度變化緩慢，酒精度0.15%vol左右，這與酵母適應新環境和氧氣濃度較高有關，隨著酵母菌指數生長期即在24～96 h呈快速增長趨勢；此時酵母菌迅速繁殖，并消耗還原糖，144 h后，酒精度的增加也比較緩慢，在240 h，黑加侖酒的酒精含量最高，達到10.61%vol。

發酵體系的還原糖含量隨著發酵時間的增加而降低，為酵母菌代謝提供所需能量，還原糖逐漸被代謝生成酒精。在發酵24～96 h，體系還原糖含量迅速下降；144 h后，酵母菌數量與酒精度增長緩慢的同時，還原糖含量也緩慢下降，240 h時還原糖含量下降至1.99 g/L，發酵結束。

2.2 酵母菌的生長動力學模型

酵母菌數的不同模型下的擬合方程及相關系數見表1。由表1可知，對Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型的擬合相關系進行了比較后可以得出：不同模型中擬合方程的R2值沒有顯著性差異，Logistic模型的擬合效果較好，擬合相關系數R2為0.986 45。因此，實驗中使用Logistic模型來擬合黑加侖酒中的酵母生長，酵母菌數量的實際值和擬合曲線見圖2。由圖2可知，酵母菌經過一段時間的適應期，在黑加侖果酒發酵24 h后生長速率開始提高，24～96 h酵母菌為對數生長，144 h后，酵母幾乎不再生長，趨于平穩，進入穩定期。

表1 酵母菌數的擬合方程及其相關系數Table 1 Fitting equation of yeast count and its correlation coefficients

圖2 Logistic模型（A）及實測值（B）下酵母菌生長擬合曲線Fig.2 Fitting curves of yeast growth under the Logistic model (A) and measured value (B)

2.3 酒精度動力學模型

Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型對酒精度的擬合方程以及相關系數見表2。由表2可知，擬合相關系數分別是0.997 69、0.997 24、0.99 42。不同模型中擬合方程的R2值沒有顯著性差異，其中，Logistic模型的擬合相關系數R2略高，為0.997 69，表明該模型可以較好地描述黑加侖果酒發酵過程中酒精度的變化。因此，本實驗選擇Logistic模型來擬合產物生成曲線，其擬合曲線見圖3。由圖3可知，酒精度在192 h后趨于平緩，最大值為10.61%vol。

表2 酒精生成擬合方程及相關系數Table 2 Fitting equation and correlation coefficient of alcohol formation

圖3 Logistic模型（A）及實測值（B）下酒精度的擬合曲線Fig.3 Fitting curves of alcohol under Logistic model (A) and measured value (B)

2.4 還原糖含量動力學模型

DoseResp模型、Logistic模型和Boltzmann模型對還原糖含量的擬合方程及相關系數見表3。由表3可知，不同模型中擬合方程的R2值沒有顯著性差異，Logistic模型擬合效果較好，擬合相關系數R2為0.996 22。該模型能夠較好地反映黑加侖果酒發酵過程還原糖含量的變化。因此，選用Logistic模型擬合基質消耗過程，結果見圖4。由圖4可知，發酵前96 h，還原糖消耗速度逐漸增大，在144 h后，酵母菌數目和酒精度的變化趨于穩定，殘糖量下降速度也逐漸變緩；發酵216 h時，還原糖含量降到2.059 g/L，這也標志著發酵結束。因此，實際生產中，可通過檢測黑加侖發酵果酒體系中的還原糖含量，來判斷果酒的發酵是否結束[22]。

表3 還原糖含量的擬合方程及其相關系數Table 3 Fitting equation of reducing sugar content and its correlation coefficient

圖4 Logistic模型（A）及實測值（B）下還原糖消耗擬合曲線Fig.4 Fitting curves of reducing sugar consumption under the Logistic model (A) and measured value (B)

3 結論

通過對黑加侖果酒發酵過程中酵母菌數、還原糖含量和酒精含量分別進行數據分析，Logistic模型，DoseResp模型，Boltzmann模型和SGompertz模型等發酵動力學經典模型對黑加侖果酒發酵均呈現較好的擬合效果，上述模型均能很好的描述黑加侖果酒發酵動力學特征，可以對其發酵過程進行定量分析和對實驗最終指標進行預測。